Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
отмывка
§ 3. Сравнительная оценка различных схем проведения гетерогенного ИФА
Как видно из предыдущего изложения, различные схемы проведения гетерогенного ИФА имеют как достоинства,так и недостатки. Несмотря на большое многообразие методов, в настоящее время невозможно выделить какой-либо из них, чтобы рекомендовать в качестве «универсального» для определения любых соединений. Выбор схемы анализа зависит от многих факторов, из Которых основными являются молекулярная масса и валентность антигена, длительность анализа, состав среды, в которой необходимо определять антиген, свойства фермента, используемого в качестве маркера, и т„ д.
Все рассмотренные методы, гетерогенного ИФА основаны на использовании меченных ферментом антигенов или антител. При наличии меченого антигена проводят анализ с использованием малостадийных конкурентных схем. Если метка введена в высоко-’ очищенный антиген, то на конечной стадии можно измерить активность конъюгата, не связанного с иммобилизованными антителами, что позволяет исключить этап отмывки иммуносорбента и делает анализ удобным для автоматизации.
С другой стороны, анализ на Основе меченых антигенов сопряжен с рядом сложностей. Разнообразие строения и физико-химических свойств антигенов препятствует созданию универсальных методов получения антигенферментных конъюгатов. Схема введения метки в один антиген часто оказывается неприемлемой при переходе к другому. По существу, синтез большинства конъюгатов антигенов с ферментами представляет собой самостоятельную задачу, сложность которой возрастает по мере уменьшения молекулярной массы и растворимости антигена.
Основной проблемой, стоящей особенно остро при введении ферментной метки в низкомолекулярные соединения, является доступность антигенных детерминант в образовавшемся конъюгате для взаимодействия с антителами. При использовании меченых гаптенов необходимо, чтобы связь маркера с ним осуществлялась через ту же функциональную группу, которая модифицировалась для синтеза конъюгата белок — гаптен для целей иммунизации и получения антител. Это накладывает дополнительные требования на выбор фермента-маркера. Кроме того, разделение конъюгата гаптен — фермент от несвязавшегося фермента, примесь которого может оказывать негативное влияние на результаты анализа, крайне затруднительно. Другим существенным условием получения меченых гаптенов является доступность очищенного антигена в значительном количестве, что осуществимо далеко не всегда.
Получение меченых антител для анализа методически более просто. Методы синтеза и очистки конъюгатов различных ферментов с иммуноглобулинами в настоящее время хорошо разработаны и унифицированы. С помощью имеющихся стандартных методик получают активные и стабильные препараты, что упрощает разработку методов иммуноферментного определения различных соединений. В ИФА могут быть использованы меченая глобулиновая фракция или IgG-фракция антител, аффинно выделенные антитела или их Fab-фрагменты. Целесообразность применения того или иного препарата следует оценивать применительно к конкретному случаю. Однако необходимо отметить, что применение меченой глобулиновой или IgG-фракции антител приводит к значительному (до 90%) непроизводительному расходу фермента-маркера, вследствие чего возрастает как стоимость анализа, так и вероятность усложнения интерпретации его результатов за счет увеличения вклада неспецифических взаимодействий.
Несмотря на универсальность методик введения ферментных меток в молекулы антител, многообразие антигенов затрудняет получение меченых специфических антител в количествах, обеспечивающих потребности массовых анализов. Кроме того, на ряд антигенов трудно получить высокоаффинные антитела, а дополнительная их модификация при связывании с ферментом может приводить к дальнейшему снижению способности взаимодействовать с антигеном.
В связи с этим применение в анализе меченых антивидовых антител упрощает процедуру получения реагентов для анализа, так как позволяет, используя одни и те же конъюгаты, осуществлять определение разных антигенов и антител различной специфичности. Кроме того, чувствительность анализа ряда антигенов в этом случае может быть выше, чем при применении меченых специфических антител, вследствие возможности связывания не одной, а нескольких меченых молекул. Однако такой подход методически усложняет проведение анализа из-за введения дополнительных стадий инкубации и промывки носителя.
Те же задачи, что и с применением меченых антивидовых, антител, могут решаться при использовании конъюгатов фермента с белком А стафилококка, способного образовывать прочный комплекс с Fc-фрагментом иммуноглобулинов. Схемы ИФА при этом аналогичны рассмотренным выше для меченых антивидовых антител. Белок А (Мг=42 000) стабилен в растворимом и лиофилизо-ванном состоянии, что позволяет на его основе получать коммерческие «универсальные» конъюгаты с пероксидазой и щелочной фос-фатазой. Ограничение 9 применении меченого белка А связано с тем, что он с различной эффективностью взаимодействует с IgG разных млекопитающих и не реагирует с IgG птиц.
