Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика иммуноферментного анализа" -> 38

Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилов Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaipraktika1999.djvu
Предыдущая << 1 .. 32 33 34 35 36 37 < 38 > 39 40 41 42 43 44 .. 123 >> Следующая

К носителю с иммобилизованным антигеном добавляют раствор определяемого антигена и раствор, содержащий фиксированное количество меченных ферментом специфических антител. После инкубации и отмывки несвязавшихся с носителем компонентов определяют ферментативную активность на носителе. Метод является твердофазным, так как носитель с иммобилизованным антигеном используют на первой стадии анализа, включает лишь одну равновесную стадию инкубации, поэтому время анализа определяется в основном продолжительностью этой стадии, однако не дает возможности избежать контакта фермента-маркера с анализируемой средой. В связи с этим ограничения его применения могут возникать при необходимости анализа биологических жидкостей (сыворотка
крови, сок растения, экстракты тканей и т. д.), способных оказывать ингибирующее или активирующее воздействие на фермент или содержащих эндогенный фермент.
Так как определяемый антиген приводит к снижению количества сорбированных на носителе меченных ферментом антител, что вызывает уменьшение регистрируемой ферментативной активности, в литературе данная схема иногда встречается под названием «ингибиторный ИФА».
Метод с использованием меченых вторичных антител и иммобилизованного антигена. Схема метода:
Метод также является твердофазным и формально имеет сходные черты с вышеописанным «ингибиторным» анализом. Отличие заключается в том, что на первой стадии используют немеченые специфические антитела, а для выявления образующихся на носителе специфических иммунохимических комплексов вводят в него ферментативную метку с помощью реакции с меченными ферментом вторичными антителами.
Метод с использованием меченого антигена и иммобилизованных антител. Схема метода:
2) отмывка
5) определение ферментативной активности
2) отмывка
К иммобилизованным на носителе антителам добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген и фиксированную концентрацию конъюгата антигена с ферментом. После проведения инкубации носитель отмывают от несвязавшихся свободного и меченого антигена и регистрируют ферментативную активность на носителе, которая обратно пропорциональна концентрации определяемого антигена. Максимальная чувствительность достигается при проведении анализа в равновесном режиме. При проведении анализа следует стремиться к уменьшению концентрации иммобилизованных антител до значений, позволяющих достоверно регистрировать связавшийся с ними меченый антиген.
# Преимуществом метода является небольшое число стадий, что позволяет легко автоматизировать анализ, а к недостаткам следует отнести сложность и неуниверсальность методов синтеза ферментных конъюгатов, особенно в случае низкомолекулярных антигенов, возможность ухудшения эффективности взаимодействия меченых антигенов с соответствующим!! антителами и, наконец, возможное влияние на ферментативную активность компонентов анализируемой биологической жидкости.
Метод с использованием меченого антигена и иммобилизован» ных вторичных антител. Схема метода:
О
-< +о© Ч +скн>
о
1) инкубация
2) инкубация
Метод относится к гомогенно-гетерогенным, так как первая стадия взаимодействия антител с определяемым и меченым антигеном проходит в растворе. После установления в системе равновесия в раствор вносят носитель с иммобилизованными вторичными антителами, которые сорбируют образовавшиеся на первой стадии специфические иммунохимические комплексы. Часто отделение образовавшегося комплекса достигается за счет образования преципитата в присутствии растворимых антивидовых антител, необходимая для полноты осаждения концентрация которых предварительно должна быть точно подобрана. После проведения стадии отмывки несвязав-шихся компонентов определяют ферментативную активность на носителе или в преципитате. В литературе этот подход часто называют методом двойных антител (англ. double antibody assay).
Гетерогенные методы ИФА антител, основанные на определении оставшихся незанятыми мест специфического связывания (тип II). К этой группе относятся два метода (см. табл. 4.4), один из которых является неконкурентным, а второй конкурентным.
Неконкурентные методы
Метод с использованием меченых антител и иммобилизованного антигена. Схема метода:
Схема по существу аналогична рассмотренному ранее методу последовательного насыщения для определения антигенов. К носителю с иммобилизованным антигеном добавляют анализируемый раствор. После установления равновесия в системе и частичного связывания анализируемых антител с носителем несвязавшиеся компоненты отмывают и добавляют меченные ферментом антитела той же специфичности. Таким образом, оставшиеся иа носителе несвязанными с антителами антигены после первой стадии инкубации оттитровываются мечеными антителами.
Конкурентные методы
Метод с использованием.меченых антител и иммобилизованного антигена. Схема метода:
К иммобилизованному антигену добавляют анализируемый раствор, содержащий фиксированное количество меченных ферментом антител. После установления в системе равновесия отмывают несвязавшиеся компоненты и определяют ферментативную активность на носителе. Необходимым условием проведения анализа является нахождение иммобилизованного антигена в недостатке по отношению к суммарному количеству свободных и меченых антител в растворе так же, как для всех конкурентных методов не исключается контакт ферментной метки с компонентами биологической жидкости, что накладывает дополнительные условия на выбор фермента.
Предыдущая << 1 .. 32 33 34 35 36 37 < 38 > 39 40 41 42 43 44 .. 123 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed