Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Метод с использованием меченого антигена и иммобилизованных антивидовых антиГел. Схема метода:
и
И
t<
>-
>-
2
1) инкубация ?
-с +
14
2) отмывка
Y
о-®
Снэ
О-®
3) инкубация
И
И
к
о®
о-®
4) отмывка
5) определение ферментативной активности
На первой стадии иммобилизованные антивидовые антитела связывают из раствора все антитела соответствующего вида. Наличие антител определенной специфичности в образовавшихся им-мунохимических комплексах выявляют титрованием антигенсвязы-вающих центров конъюгатом соответствующего антигена с ферментом. Метод основан на выявлении из множества связавшихся с иммуносорбентом антител молекул только одной специфичности, поэтому возможность его эффективного применения снижается при способности меченого антигена к неспецифическому связыванию с иммобилизованными на носителе белками или адсорбировавшимися на них после первой инкубаций иммуноглобулинами.
Гетерогенные методы ИФА антигенов, основанные на определении оставшихся свободными центров специфического связывания (тип II). Схематично эта группа методов представлена в табл. 4.3. По сравнению с анализом типа I эти методы многочисленные и включают в себя как неконкурентные, так и конкурентные подходы, причем каждый из них в зависимости от использования на Первой стадии иммобилизованного реагента делится на твердофазный или гомогенно-гетерогенный. Рассмотрим каждый метод с учетом типа реченого и иммобилизованного реагента.
Метод с использованием меченых антител
и иммобилизованного антигена. Иммуноферментометрический метод. Метод является гомогенно-гетерогенным. Схема метода:
На первой стадии анализируемый образец смешивают с рас-, твором, содержащим фиксированное количество меченных ферментом специфических антител. После инкубации и обр'азования специфических иммунокомплексов в систему вводят избыток иммобилизованного антигена, который сорбирует оставшиеся несвязанными меченные антитела. После отмывки определяют ферментативную активность на носителе, которая обратно пропорциональна содержанию исследуемого антигена в образце. В литературе метод можно встретить под названием иммуноферментометрический.
# Следует отметить, что с иммобилизованным антигеном могут связываться не только свободные меченые антитела, но и антитела, провзаимодействовавшие с определенным антигеном только одним активным центром. Вероятность такого взаимодействия возрастает с уменьшением размеров антигена, что следует учитывать при определении конкретных соединений. Разделение компонентов на иммуносорбенте целесообразно проводить в кинетическом режиме, поэтому эта стадия не лимитирует время анализа в целом. Недостаткам метода является контакт ферментной метки с анализируемым образцом, что может вызвать изменение ферментативной активности.
Метод с использованием меченых вторичных антител и иммобилизованного антигена. Метод также является гомогенно-гетерогенным и имеет сходные черты с вышеописанным нммуноферментомет-рическим анализом. Отличие его заключается в том, что на первой стадии используют немеченые специфические антитела, а образующийся на твердой фазе комплекс выявляют с использованием меченых вторичных антител. Схема метода:
о
о
>-
>-
1) инкубация
о>-
о>-
>~
2) инкубация
|ю>- /»-®' \>-©,
ю>
“ 6) определение ферментативной актив иосги
• Метод более длителен в проведении по сравнению с предыдущим, однако в нем исключается контакт исследуемой жидкости с ферментной меткой и можно использовать, одий и тот же антивидо-вой конъюгат для анализа различных антигенов. ,
Метод с использованием меченого антигена и иммобилизованных антител (последовательного насыщения). Так как на первой стадии используется твердая фаза с иммобилизованными антителами, метод относится к твердофазным. Схема метода:
Я
й к
О + О
о
1) инкубация
•ЧО
Но о 14
jKo о-®
|-<0 + О-® |-< Снэ
2) отмывка
J
3) инкубация ^ “!
чо
Но
о-® 4) отмывка
о-®
40
No
<СО~0
Иммобилизованные антитела инкубируют с раствором, содержащим определяемый антиген. После отмывки к носителю добавляют меченный ферментом антиген, который взаимодействует со свободными антигенсвязывающими центрами антител.
• Длительность всего анализа обусловлена в основном временем первой стадии, которую целесообразно проводить в равновесном режиме. Метод позволяет предотвратить влияние биологической жидкости на активность фермента, так как вторая реакция проводится после отмывки иммуносорбента.
Конкурентные методы
Метод с использованием меченых антител и иммобилизованного антигена. Схема метода:
