Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Аг
Ат
>-
>-
>-
>-
о>-о>-о >-
Тип 1
Определение
специфических
комплексов
1 Тип 11 Определение свободных центров связывания Ат
Схема 4.1
При крайне низких концентрациях компонентов образование простого бинарного комплекса антиген-антитело не может быть зарегистрировано ни визуально, ни простыми инструментальными методами, что вызывает необходимость усложнения аналитической системы. Одним из путей «визуализации» образования комплекса является использование меченых соединений, в которых метка может легко детектироваться в концентрациях, сопоставимых с определяемой концентрацией анализируемого соединения. Как правило, от типа метки зависит название анализа — радиоиммунологический анализ, флуоресцентный иммуноанализ, иммунокофакторный анализ, иммуноферментный анализ и т. д.
Возможность применения ферментов в качестве метки в иммуноанализе обусловлена, прежде всего, их высокой каталитической активностью, позволяющей с применением соответствующих субстратных систем регистрировать ферменты в растворе на уровне 10-15 М и ниже. Благодаря широкому развитию методов энзимоло-гии принципиально решена проблема введения ферментной метки в молекулы антигенов и антител, что позволяет в настоящий момент легко осуществить связывание молекул ферментов с другими соединениями с целью получения соответствующих конъюгатов.
Второй общей стадией любого метода ИФА является формирование связи меченного ферментом соединения со специфическим
комплексом или свободными центрами связывания. В некоторых схемахVконкурентный анализ) образование комплекса с меченным ферментрм соединением может проходить одновременно с первой стадией «узнавания» антителами специфических антигенов. И, наконец,^последним обязательным процессом в ИФА является «трансформация» ферментной метки в соответствующий сигнал, измеряемый различными физико-химическими методами (спектрофотометрическими, флуориметрическими, люминесцентными и т. д.), что достигается путем проведения реакции фермента с субстратами.
Во всех методах ИФА может измеряться ферментативная активность меченого соединения, находящегося в специфическом иммунном комплексе или же в комплексе со свободными, не вступившими в реакцию центрами связывания. Именно этот принцип может быть положен в основу классификации всех методов ИФА. В первой группе методов ИФА (тип I, схема 4.1) ферментная метка находится в образовавшемся специфическом комплексе анализируемого антигена и антитела, поэтому очевидно, что возрастание концентрации определяемого соединения будет сопровождаться увеличением концентрации образующегося специфического иммунохимического комплекса, а следовательно, более высоким регистрируемым сигналом. Очевидно, что в этом случае калибровочный график, представляющий собой зависимость регистрируемого сигнала от концентрации анализируемого соединения, должен описываться возрастающей функцией.
Во второй группе методов (тип II, схема 4.1) с помощью ферментной метки выявляются-оставшиеся свободными центры связывания. Следовательно, калибровочная кривая описывает уменьшение регистрируемого сигнала от максимального значения, соответствующего нулевой концентрации антигена до определенного уровня, характеризующего концентрацию исследуемого антигена.
Проведение количественной оценки образовавшихся в первичном процессе «узнавания» анализируемого соединения комплексов или же оставшихся свободными мест специфического связывания может осуществляться в один или несколько этапов.
Очевидно, что в анализе типа I количество образовавшихся специфических иммунных комплексов может быть намного меньше, чем общее количество центров связывания, так как измерение активности проводится от нулевого уровня (в отсутствие неспецифических взаимодействий). Для достижения максимальной чувствительности определения исследуемого соединения необходимо иметь избыток центров связывания, так как в этом случае концентрация образующегося специфического комплекса будет максимальна.
В анализе типа II концентрация образовавшихся на первой стадии иммунохимических комплексов вычисляется по разности начальной концентрации центров специфического связывания и измеряемой экспериментально концентрации оставшихся свободными
центров специфического связывания. Для достижения достаточной точности разности необходимо, чтобы количество образующихся иммунных комплексов было сравнимо с количеством оставшихся свободными центров специфического связывания. Очевидно, что такой подход в проведении анализа налагает более жесткие требования как на соотношение концентраций используемых в анализе реагентов, так и на константу связывания и-концентрацию определяемого соединения.
В литературе иногда можно встретить классификацию методов ИФА, основанную на том, находится ли определяемое соединение в избытке или недостатке по отношению к центрам связывания. Однако этот подход не однозначен, так как лимитирующим является не только соотношение между концентрациями компонентов реакционной системы, но и концентрациями и равновесной константой комплексообразования специфического иммунохимического комплекса. Поясним сказанное на примере. Если концентрация определяемого антигена [Аг]о = 10~10 М, а концентрация добавленных специфических антител [Ат]о=10-8 М, то при равновесной константе, равной 1Q8 М.-1, только 50% антигена (0,5-Ю~10 М) окажется связаннным в иммунохимический комплекс. При обратном соотношении компонентов ([Аг}о=10~8 М, [Ат]0=Ю~10 М) и той же константе равновесия концентрация комплекса останется той же самой, а следовательно, можно провести ее прямое определение одним и тем же способом. Однако по такой классификации, несмотря на проведение анализа одним и тем же способом, следует отнести его к двум различный типам, что, очевидно, нецелесообразно.
