Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
<3* * _
Я" S* О К « #: в *§ ав
СП
Ъ4*.
Н
cd •
<? Cd
О со СО СО
о ав м о
I®
К
е
м.
cd
И
О
|5
ч *
Я в
& ° ч.
н
cd к_
J э”
5? Ч" й> •
е*
К
Ч
cd
Рн
С)? 00. ^ *4
о<
X
ч
К
ё
о
о<
о
с
св
а*
Л
К
К
ч
о
.3
См. табл. 4.1.
Другие ферменты, перечисленные в табл. 3.1, находят гораздо меньшее практическое использование в гетерогенных методах ИФА. Ацетилхолинэстераза обладает высокой удельной активностью и низким значением Кт; активность можно измерять как с помощью рН-электрода, так и фотометрически. Каталаза имеет наивысшую каталитическую активность, однако недостатком является необходимость слежения за реакцией в УФ области, что
Т а блица 3.3. Минимальные определяемые количества ферментов фотометрическим и флуориметрическим методами
Ннжннй предел
обнаружения фермента
в пробе (амоль,
Фермент Субстрат флуорнмет- фотометри
рнческая ческая
регистрация регистрация
Пероксидаза хрена о-Фениленднамнн 4
я-Окснфенилпропноновая ки 1 ---
слота
P-D-галактозндаза о-Ннтрофеннл-Р-О-галактозид --- 170
Е. coli 4-Метнлумбеллнфернл-(5-0-га- 0,03
лактозид
Щелочная фосфата- я-Ннтрофеннлфосфат --- 1700
за кншечннка теленка 4 - Метнлумбеллнфернл фос 4,7 ---
Г люкозооксндаза 8 ---
* См. табл. 4.1.
не всегда возможно. Существуют теоретические методы опредё-ления ее активности, однако они недостаточно чувствительны. В случае уреазы имеются некоторые проблемы со стабильностью конъюгатов, возможно связанные с окислением сульфгидриль-ных групп фермента, приводящим к инактивации. Наиболее распространенным среди гомогенных методов в настоящее время является так называемый EMIT-анализ, в, котором в качестве метки молекул антигенов использована глюкозо-6-фосфатдегидро-геназа. Высокая активность фермента по NAD позволяет использовать его при анализе гемолизированных образцов крови, в которых возможно присутствие фермента, имеющего специфичность по NADP. Малатдегидрогеназа — очень активный фермент, однако он имеет ограниченное применение — только в анализе мочи. В гомогенном ИФА лизоцим имеет лишь историческое значение.
Чувствительность многих вариантов иммуноферментных методов анализа может быть ограничена наименьшей регистрируемой концентрацией ферментативной метки в растворе, поэтому чем в более низкой концентрации возможно определение меченного
ферментом антигена или антитела, тем лучшими характеристиками будет обладать данный метод ИФА.
В табл. 3.2 даны предельные значения (в амолях, 10-18 моль) количества ферментов, детектируемых в растворе или на носителе при регистрации ферментативной активности в течение 1 ч фотометрическим или флуориметрическим методами.
Для сравнения отметим, что удельная активность обычно используемого в радиоиммунологическом анализе радиоизотопа 1251, имеющего период полураспада 60,2 дня, составляет 4,8 распада в 1 мин на 1 амоль.
• Таким образом, из данных таблицы следует, что флуориметри-ческий метод регистрации каталитической активности p-D-галак-тозидазы позволяет выявлять значительно меньшие количества метки, чем радиоизотопный. Для других ферментов эти величины являются сравнимыми, а следовательно, по своей чувствительности иммуноферментные методы анализа не должны уступать радиоиммунологическим.
При разработке конкретного варианта ИФА перед исследователем встает проблема выбора фермента в качестве метки. Для правильного выбора следует учитывать многие факторы: например, в гомогенном ИФА в исследуемом образце должны отсутствовать свободный фермент-метка, или фермент, имеющий сходную с ним специфичность, ингибиторы или активаторы фермента и т. д. Выбор фермента может быть обусловлен также и целями ИФА. Например, при одновременном анализе очень большого числа образцов, выполняемого в течение довольно длительного времени, необходимо для уменьшения ошибки анализа использовать более стабильные субстраты. Гидролитические ферменты, например щелочная фосфатаза и p-D-галактозидаза, имеют более стабильные субстраты, чем оксидоредуктазы, такие, как пероксида-за и глюкозооксидаза, поэтому последние менее предпочтительны в случае реакции с продолжительным периодом инкубации, но могут быть с успехом использованы в быстрых методах иммуноанализа.
