Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
В качестве детектирующих систем в иммуноферментном анализе нашли также применение ферментативные реакции, энергия которых реализуется в виде светового излучения — реакции био-и хемилюминесценции. За скоростью таких реакций следят по интенсивности свечения реакционной системы, регистрируемой с помощью люминометра. Реакции биолюминесценции катализируются люциферазами светляков и бактерий, а реакция окисления циклических гидразидов перекисью водорода (реакция хемилюминесценции) катализируется пероксидазой хрена (см. гл. 4).
В последние годы распространение получают электрохимические способы определения активности ферментов, используемых в качестве меток в иммуноанализе. Такие датчики позволяют проводить определение скорости ферментативных реакций в мутных средах и удобны для создания проточных иммуноферментных ячеек.
Основные кинетические закономерности протекания ферментативных реакций. В иммуноферментных методах анализа в качестве метки антигенов и антител могут использоваться как ферменты, так и их субстраты. Если меткой служит молекула фермента, то выбранный способ детекции должен обеспечивать регистрацию сигнала, пропорционально зависимого от концентрации (количества) фермента, а в случае применения в качестве метки субстрата — концентрации (количества) субстрата. В первом случае фермент выполняет роль маркера (он ковалентно связан с молекулой антигена или антитела), во втором — детектора (свободный фермент). Оптимизация условий каталитической реакции (выбор pH, оптимальных концентраций фермента и субстратов) осуществляется в соответствии с используемой модификацией И ФА.
Рассмотрим основные кинетические закономерности протекания ферментативных реакций и принципы, на которых базируется употребление ферментов в качестве меток в ИФА.
После проведения всех иммунохимических стадий любого метода ИФА необходимо установить концентрацию (или количество) меченного ферментом компонента иммунохимической реакции, т. е. определить каталитическую активность фермента. Для этого в систему добавляют соответствующие субстраты фермента и измеряют скорость ферментативной реакции. По наблюдаемой скорости реакции судят о концентрации фермента-маркера в системе. Очевидно, что для этого необходимо наличие пропорциональности между концентрацией фермента и измеряемой скоростью ферментативной реакции, т. е. выполнение соотношения
v=k[E]a. (4.6)
Следует отметить, что так как ИФА всегда строится на сравнительном определении в идентичных условиях стандартного и измеряемого образца, то требование пропорциональности скоро-
сти и концентрации является скорее желательным, чем обязательным для разработки конкретного метода ИФА. Достаточным является существование взаимно однозначного соответствия между количеством образовавшегося продукта ферментативной реакции и количеством фермента в системе. Однако выполнение условия пропорциональности в определенном диапазоне концентраций обеспечивает, как правило, большую точность эксперимента и, кроме того, позволяет построить теоретическую модель и провести математическое описание метода с целью его оптимизации.
В простейшем случае односубстратных ферментативных реакций, подчиняющихся кинетике Михаэлиса—Ментен, зависимость начальной скорости от концентраций субстрата и фермента в стационарном режиме описывается уравнением
IS)o &кат IE]o [S]o (4 7)
Kn,+ [Slo Km + [S]o 1 ¦ }
(где FM — максимальная скорость; [S]o — начальная концентрация- субстрата; Km — константа Михаэлиса; k кат — каталитическая константа скорости; [Е]о — начальная концентрация фермента), которое отражает пропорциональность между наблюдаемой скоростью ферментативной реакции и концентрацией фермента в растворе. Чтобы снизить ошибку в определении скорости ферментативной реакции, ее ведут обычно в условиях, когда [S]o>-^>Кт, т. е. находят максимальную скорость, ферментативной реакции (V max).
• На практике при проведении ферментативной реакции на последней стадии нммуноферментного анализа обычно измеряют не скорость ферментативной реакции, а оптическую плотность или флуоресценцию продукта через определенный фиксированный промежуток времени. Для того чтобы такое измерение было эквивалентно определению скорости реакции, необходимо, чтобы кинетические зависимости накопления продукта реакции от времени имели вид прямых во всем временном диапазоне. В таком случае оптическая плотность раствора (или интенсивность флуоресценции продукта реакции), измеренная через фиксированный интервал времени после начала ферментативной реакции, будет реально отражать концентрацию фермента в системе. Так как скорость реакции, согласно уравнению (4.7), сильно зависит от концентрации субстрата, проводить ее следует на такую глубину, чтобы можно было пренебречь расходованием субстрата в ходе ферментативной реакции (т. е. выполнялось условие [SJo^const). В противном случае ввиду уменьшения концентрации субстрата в системе скорость ферментативной реакции будет постепенно падать, а следовательно, измеряемая через фиксированный промежуток времени оптическая плотность не будёт отражать истинную концентрацию фермента в растворе.
