Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
• Выяснение механизма и поиск путей максимального (и универсального) снижения неспецифического связывания является одной из насущных задач ИФА, так как этот параметр в значительной степени определяет чувствительность анализа. Например,
Рис. 27. Взаимодействие меченных ПХ антител с комплексом антиген-поликлональные антитела, предварительно адсорбированные в различных концентрациях Ат на полисти-рольных планшетах для ИФА:
на носителе и в конъюгате против HBs — антигена (1) и инсулина (2), 0,01 М фосфатный буфер, содержащий 0,1 М NaCl и 0,1% тритона Х-100, pH 7,4
216
теоретическая чувствительность «сэндвич»-метода, без учета неспецифических взаимодействий, лимитируется только пределом обнаружения метки. Увеличивая концентрацию иммобилизованных и меченых антител, в идеальном случае можно значительно снижать нижний предел детекции антигена. Однако реально возрастающий при этом вклад неспецифических взаимодействий делает этот путь неосуществимым.
§ 5. Некоторые свойства иммобилизованных антител
Применение в ИФА иммуносорбентов позволяет проводить определение любых соединений, независимо от их валентности, размеров, структуры и молекулярной массы. Однако возможности твердофазных систем анализа (ни'&ний предел обнаружения антигена, время, воспроизводимость) в значительной степени определяются такими величинами, как концентрация, аффинность и стабильность иммобилизованных антител. В связи с этим ниже дана краткая информация об этих параметрах и путях их определения на примере наиболее распространенных пористых и непористых носителей.
Концентрация иммобилизованных антител. Эта величина является одним из основных параметров, варьированием которого можно оптимизировать чувствительность и длительность анализа. Для успешной разработки метода ИФА знание точного значения этой концентрации необязательно. В большинстве случаев экспериментатор оперирует понятиями «количество, или концентрация иммуносорбента» (при использовании гранулированных носителей) или «концентрация белка при адсорбции» (для непористых полимерных материалов). Точное знание концентрации необходимо в тех случаях, когда ставится задача изучения физико-химических характеристик взаимодействия антиген — антитело либо получения исходных данных для оптимизации схемы ИФА на ЭВМ.
Определение концентрации иммобилизованных антител методически довольно сложно. Чаще всего для связывания с носителем используют IgG-фракцию иммунной сыворотки, точное содержание антител в которой неизвестно. Поэтому простое определение концентрации связавшегося с носителем белка не дает нужной информации. При иммобилизации аффинно выделенных антител, определив убыль белка из исходного раствора в процессе связывания и учтя количество антител, десорбировавшихся в результате промывок сорбента, можно найти суммарное количество молекул, присоединившихся к носителю. В результате подобных экспериментов может быть установлена емкость носителя, т. е. количество молекул антител, которое при данном методе им-
217
мобилизации связывается с единицей массы или площади носителя (например, мг/г или мг/см2).
Однако в большинстве случаев интересуются не общим количеством связанных антител, а антителами, сохранившими способность к взаимодействию с антигеном после иммобилизации. Часть молекул антител может утратить эту способность в результате присоединения к носителю антиген-связывающими центрами, сте-рического экранирования или других причин. Абсолютное число активных антител можно определить методом титрования активных центров антител антигеном. Существующие подходы позволяют проводить исследование с использованием как высоких, так и низких концентраций антигена и иммуносорбента. В первом случае иммуносорбент инкубируют с избытком антигена, затем диссоциируют специфический комплекс при pH 2—2,2 или раствором с высокой концентрацией солей (2—5 М) и определяют количество выделившегося антигена. Этот подход требует больших количеств сорбента и допускает возможность значительных ошибок вследствие смывания антител с носителя при экспериментальных значениях pH или ионной силы.
Значительно более прецизионный подход основан на титровании активных центров иммобилизованных антител меченым антигеном. В качестве метки целесообразно использовать низкомолекулярные соединения (изотоп, флуоресцирующий краситель, кофактор и т. д.), чтобы в максимальной степени снизить вероятность экранирования меткой антигенных детерминант. Суть метода заключается в насыщении микроколичеств иммуносорбента меченым антигеном. Получаемая в результате опыта изотерма адсорбции позволяет вычислять концентрацию и константы связывания иммобилизованных молекул антител. Так как в подобном эксперименте определяется не абсолютная концентрация активных центров антител, а концентрация центров, доступных для взаимодействия с антигеном, следует ожидать, что эта величина будет различной для антигенов с разными размерами и молекулярной массой. Например, при иммобилизации антител разной специфичности часть центров может экранироваться носителем от контакта с макромолекулярным антигеном, но быть доступной для низкомолекулярного.
