Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Количественная оценка степени перекрестной реактивности антигенов. В ряде случаев трудно бывает достичь абсолютной специфичности взаимодействия моноклональных антител с антигеном, но такие антитела, тем не менее, могут быть использованы в иммуноанализе при условии, что концентрация перекрестно реагирующих антигенов в анализируемых образцах невелика.
172
Для некоторых целей бывает необходимо получить моноклональные антитела с максимально широким спектром перекрестной реактивности. Количественная характеристика перекрестной реактивности определяется по степени ингибирования связывания моноклональных антител с иммобилизованным агентом в присутствии растворимого перекрестно реагирующего антигена. Степень перекрестной реактивности исследуемых антигенов характеризуют индексом «/50», представляющим собой концентрацию конкурирующего антигена, которая достаточна для ингибирования на 50% процесса связывания фиксированного количества моноклональных антител с иммобилизованным антигеном, использованным для получения моноклональных антител.
Полуколичественная оценка /50 на ранних стадиях культивирования гибридом может быть осуществлена методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. В лунки платы для микротитрования, покрытые антигеном, использованным для получения моноклональных антител, помещают по 25 мкл растворенного в фосфатно-солевом буфере с тритоном перекрестно реагирующего антитела, концентрацию которого варьируют от 1 • 10~6 до 1 • 10-10 М. Затем в каждую лунку добавляют 25 мкл среды культивирования гибридом, разведенной в 2 раза буфером, содержащей моноклональные антитела. Аналогичным образом параллельно титруют исходный антиген, к которому были получены моноклональные антитела. В качестве контроля титрование сходного и перекрестно реагирующего антигенов осуществляют в присутствии 25 мкл разведенной в 2 раза среды культивирования гибридом, не содержащей моноклональных антител. Контрольные и опытные образцы инкубируют 1 ч при 37°С, а затем обрабатывают планшеты по методике для проведения непрямого твердофазного иммуноферментного анализа.
• Оценивая значение оптического поглощения раствора субстрата после внесения его в лунки микроплаты, выявляют те концентрации конкурирующих антигенов, которые ингибируют на 50% связывание моноклональных антител с иммобилизованным на полистироле антигеном. Степень перекрестной реактивности оценивают отношением ho перекрестно реагирующего антигена к /5о исходного: чем оно больше, тем меньше степень перекрестной реактивности.
Отбор моноклональных антител, связывающихся с различными эпитопами на антигене. Для высокоспецифического выявления ряда антигенов наиболее удобной является «сэндвич»-модификация твердофазного иммуноферментного анализа. Использование в таком типе анализа двух моноклональных антител, взаимодействующих с разными эпитопами, позволяет сократить время анализа. Кроме того, такие пары моноклональных антител в ряде случаев обладают большей авидностыо по сравнению с аффинностью каждого отдельного антитела. Для выявления антител, связывающихся с различными центрами на антигене, обычно используют три метода.
173
Первый заключается в химическом или ферментативном расщеплении взаимодействия с моноклональными антителами.
Второй метод основан на формировании преципитатов в случае, когда все молекулы антител связываются одновременно. Этот метод очень прост, однако обладает низкой чувствительностью.
Третий метод состоит в приготовлении моноклональных антител, меченных ферментом или радиоизотопом, и определении возможности меченых и немеченых моноклональных антител конкурировать за одни и те же центры связывания на антигене. Этот метод обладает высокой точностью, однако требует введения метки в каждый вид антител и оценки конкуренции для каждой пары. Этот метод не применяется, если необходимо проанализировать моноклональные антитела большого количества гибридом. Необходимо иметь в виду, что на ранних стадиях получения гибридом количество имеющихся в наличии моноклональных антител ограничено. Это делает невозможным их отбор рассматриваемым методом.
Наиболее простым и чувствительным способом выявления антител, способных одновременно связываться с антигеном, является тест на аддитивность связывания. Предварительная очистка и введение метки в моноклональные тела в этом случае не нужны. В основе метода лежит оценка числа антигенных центров, одновременно доступных для пары антител. Определение осуществляется методом непрямого твердофазного иммуноферментногО анализа. Основным условием при этом является полное насыщение антигена обоими типами антител. Поэтому на первой стадии эксперимента необходимо получить кривые насыщения антигена аСцит..ой или культуральной жидкостью, содержащей анализируемые антитела, и затем определить максимальную оптическую плотность в иммунофермент-ном тесте, достигаемую при насыщении.
Для того чтобы проверить, действительно ли антиген насыщен антителами и выход кривой титрования на плато достигается не за счет низких концентраций иммуноферментного конъюгата, эксперимент повторяют с удвоенной концентрацией последнего. Если оптическая плотность при этом существенно не изменяется по сравнению с предыдущим экспериментом, считают, что насыщение достигнуто.
