Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика имуноферментного анализа" -> 65

Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика имуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaimuntoferniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 59 60 61 62 63 64 < 65 > 66 67 68 69 70 71 .. 115 >> Следующая

Наращивание гибридом в виде асцитов. Мышам линии Balb/c
2—3-месячного возраста внутрибрюшинно вводят 0,5 мл пристана (2, 6, 10, 14-тетраметилпентадекана). Через 7 дней мышам вводят 106—107 клонированных гибридомных клеток в 0,5 мл ДМЕМ-рос-товой среды. Клетки должны находиться в экспериментальной фазе роста. На 14—21-й день отбирают 4—5 мл асцитной жидкости.
Замораживание гибридомных клеток. Замораживание необходи-
168
мо осуществлять на всех стадиях получения гибридом. Скорость снижения температуры Г в 1 мин. В специальные стерильные ампулы для замораживания, охлажденные до 0°С, помещают 107 клеток, суспензированных в фетальной сыворотке, содержащей 5% диметил-сульфоксида. Ампулы помещают на ночь в холодильник (—70°С). На следующий день ампулы переносят в жидкий азот.
Размораживание клеток проводят быстро, помещая пробирки в водяную баню с / = 37°С. Размороженные клетки разводят Юмлгиб-ридомной среды и осаждают центрифугированием. Осадок ресус-пензируют в ростовой гибридомной среде до плотности 4-105 клеток/мл и помещают по 0,2 мл в 96-луночные микроплаты. Только что размороженные клетки хорошо растут при концентрации сыворотки в среде 20%- После того как начался рост, концентрацию сыворотки уменьшают до 5—10%.
Хранение моноклональных антител. Моноклональные антитела могут быть сохранены в виде лиофильно высушенной культуральной жидкости, однако при этом часто происходит потеря иммунологической активности. Культуральная надосадочная жидкость хорошо хранится в течение 1 г при 4°С в присутствии 0,1% азида натрия. Она может быть сохранена неопределенно долго при замораживании (/ = 70°С); при этом необходимо избегать повторного замораживания и оттаивания.
Асцитная жидкость полностью стабильна при хранении в стерильном состоянии при 4°С. В течение долгого времени моноклональные антитела могут храниться при 4°С в 50%-ном сульфате аммония.
§ 2. Использование моноклональных антител в иммуноанализе
Основным достоинством моноклональных антител является возможность их получения в неограниченных количествах с идентичными от партии к партии физико-химическими характеристиками. Это позволяет создавать на их основе стандартные диагностические реагенты.
Хотя сам процесс получения гибридом достаточно трудоемок и дорог, тем не менее, после того как гибридома получена, крупномасштабное производство моноклональных антител стоит довольно дешево и все затраты на получение гибридом себя оправдывают. В качестве недостатка моноклональных антител часто указывают на нестабильность гибридом и возможную потерю ими продукции. Однако большинство гибридом достаточно стабильно, если их ре-клонировать 1—2 раза в год.
• Большим преимуществом использования гибридом является то, что в процессе клонирования и отбора исследователь может выбрать гибридомы с желательными для него свойствами в отношении специфичности взаимодействия, констант аффинности, физико-хими-
169
ческих свойств, влияющих на возможности их использования в анализе. Получить поликлональные антитела с нужными свойствами из сыворотки животных значительно труднее.
Все моноклональные антитела имеют одинаковую специфичность, одинаковы по аффинности, относятся к одному классу и подклассу. Поскольку моноклональные антитела являются нормальным компонентом иммунного ответа организма, то они могут распознавать общие эпитопы на разных антигенах или полиморфные формы одного и того же эпитопа. Однако моноклональные антитела могут распознавать только одну из полиморфных форм эпитопа и могут не распознавать другие полиморфные формы молекулы антигена.
В очень редких случаях может наблюдаться перекрестная реактивность моноклональных антител по отношению к неродственным антигенам. Это связано со сходным пространственным распределением зарядов, полярности и гидрофобности на отдельных участках таких молекул. Подобная ситуация реализуется, например, при взаимодействии эндорфинов и алкалоидов с одними и теми же клеточными рецепторами. Однако по отношению к моноклональным антителам перекрестная реактивность подобного рода наблюдается крайне редко. Размеры структур, распознаваемых моноклональными антителами, меньше, и распознаются они точнее, чем структуры, распознаваемые смесью поликлональных антител. Учитывая то, что антигенсвязывающий центр антител имеет полицентровую структуру, необходимо помнить, что направленность моноклональных антител к одному эпитопу и высокая специфичность не исключает возможности их перекрестной реактивности с эпитопами схожей химической структуры, хотя при этом обычно наблюдается различие констант связывания.
Высокая специфичность моноклональных антител позволяет создать имму но ферментные диагностикумы для определения антигенов, которые имеются в ограниченных количествах или же недоступны в очищенном состоянии. В таких случаях для иммунизации животных и получения гибридом может быть использован препарат, содержащий около 1 % антигена. Высокоочищенный антиген необходим на стадии тестирования гибридом; однако при наличии высокочувствительного метода определения нужные количества антигена исчисляются несколькими микрограммами. После получения гибридомы антиген может быть выделен методом аффинной хроматографии на моноклональных антителах. Полученный в вы-сокоочищенном состоянии в значительных количествах антиген в дальнейшем может быть использован в составе иммуноферментных диагностикумов.
Предыдущая << 1 .. 59 60 61 62 63 64 < 65 > 66 67 68 69 70 71 .. 115 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed