Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
166
человеческими лимфоцитами. Однако практического значения такие гибридомы не нашли из-за генетической нестабильности. Более успешным оказались эксперименты, в которых для слияния используют лимфоциты периферической крови человека и человеческие опухолевые клетки. Такие гибридомы синтезируют моноклональные антитела к антигенам, участвующим в возникновении аутоиммунных заболеваний.
Получение моноклональных антител с более низкой антигенно-стью по отношению к человеку может быть осуществлено с помощью генноинженерных методов. Моноклональные антитела, созданные с помощью этого подхода («химерные»), включают активный центр из иммуноглобулина мыши, а остальную часть молекулы, Fc-фраг-мент, — из иммуноглобулина человека.
Методы по получению моноклональных антител постоянно развиваются и совершенствуются. Это позволило расширить границы их применения в практических целях и сделать целый ряд открытий теоретического характера в области молекулярной биологии и иммунохимии.
Получение гибридомы, синтезирующей моноклональные антитела к инсулину. Материалы.
1. Полная среда Дульбекко в модификации Игла (ДМЕМ-среда): 450 мл ДМЕМ; 5 мл пирувата натрия (100 мМ); 5 мл пенициллина и стрептомицина (10 000 ед. в 1 мл); 5 мл L-глутамина (200 мМ); 0,25 мл 2-меркаптоэтанола (0,1 М); 50 мл фетальной сыворотки теленка.
2. НАТ-среда и НТ-среда. Содержат ЫО-4 М гипоксантина, 1,6-Ю-5 М тимидина, 4-10-7 М аминоптирина в полной ДМЕМ-среде.
3. Солевая среда, содержащая глюкозу (автоклавируется или стерилизуется фильтрованием): 8 г NaCl; 0,4 г КС1; 1,77 г Na2HP04X2H20; 2 г глюкозы; 0,01 г фенолового красного; вода до 1 л.
4. «Сшивающий» раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ): 50% ПЭГ, Мт — 4000; 45% солевой среды, содержащей глюкозу; 5% диметилсульфоксида.
5. Замораживающая среда: 9 мл сыворотки (фетальной или лошадиной); 1 мл диметилсульфоксида.
Иммунизация мышей. 30—50 мкг инсулина растворяют в 0,1 мл 0,15 М раствора NaCl, pH 7,4; смешивают с равным объемом адъюванта Фрейнда и вводят мышам внутрибрюшинно. Через 4—5 недель повторно вводят 30 мкг инсулина в неполном адъюванте Фрейнда внутрибрюшинно. За 3—4 дня до слияния вводят 20 мкл инсулина без адъюванта внутрибрюшинно и 10 мкг внутривенно.
Слияние клеток. Селезенку иммунизированной мыши измельчают в стеклянном гомогенизаторе, заполненном солевой средой с глюкозой. 108 селезеночных клеток и 2 -107 миеломных клеток мыши промывают солевым раствором с глюкозой, центрифугируют 10 мин при 200 g. Надосадочную жидкость осторожно удаляют пипеткой. К осадку в течение 1 мин по каплям добавляют 0,5 мл «сшивающего» раствора ПЭГ, разбивая осадок. Суспензию оставляют стоять
10 мин, после этого разбивают комки клеток пропусканием через пипетку. Клетки суспензируют в 50 мл НАТ-среды и разливают по
167
100 мкл в 96-луночные микроплаты, содержащие 15 000 перитональ-ных макрофагов на лунку.
Клетки выращивают в увлажненном термостате при 37°С в атмосфере 5% С02. Через первые 3 дня, а затем дважды в неделю 7з среды удаляют пастеровской пипеткой и заменяют свежей НАТ-средой. Через 7—10 дней НАТ-среду заменяют НТ-средой. Когда растущие на селективной среде клетки занимают 10—20% площади лунки, недостаточную культуральную жидкость тестируют на наличие специфических антител.
Тестирование гибридом. Пипеткой удаляют по 50 мкл среды из каждой лунки платы для культивирования и переносят среду в лунки полистирольных плат, на поверхности которых сорбирован антиген. Инкубируют 1 ч при 37°С и отмывают непрореагировавшие компоненты 0,01 М фосфатом натрия, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20 (ФБРТ). В лунки добавляют 50 мкл конъюгата кроличьих антимышиных иммуноглобулинов с пероксидазой, растворенного в фосфатном буфере с тритоном (ФБР), содержащем 0,5% бычьего сывороточного альбумина, инкубируют 1 ч при 37°С, после чего промывают лунки ФБТ 3 раза. Для определения ферментативной активности лунки заполняют 0,2 мМ раствором ABTS в 0,05 М цитратном буфере pH 4,0, содержащем 0,1 мМ Нг02. Результаты реакции учитывают через 30 мин, проводя измерения на фотометре при 412 нм.
Клонирование гибридом методом предельных разведений. Содержимое лунок, показавших положительный результат при тестировании, изучают под микроскопом и оценивают, содержат ли они одну или большее число гибридом. Клетки разводят до концентрации 3 клетки/мл и распределяют по 0,2 мл в 96-луночные микроплаты, в которых содержится 5-104 филерных клеток (макрофагов или тимоцитов) на лунку. Отдельные клоны клеток, выросшие в лунках через 10 дней, тестируют методами иммуноферментного анализа, как описано выше.
Наращивание гибридом. Клоны, которые оказались положительными, наращивают, пока они не займут 2/з поверхности 96-луночной платы. После этого их переносят в лунки 24-луночных плат, содержащих по 1 мл ростовой среды. Через несколько дней клетки из нескольких лунок этих плат объединяют и переносят в 50 мл флаконы для культивирования. Оптимальная для роста плотность клеток — 500 тыс. на 1 мл. После этого клетки могут быть помещены в сосуды для культивирования объемом 250 мл и более.
