Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Гибридомы отбирают по их свойству размножаться на НАТ-сре-де. Присущая миеломным клеткам способность к быстрому размножению восстанавливается за счет привнесения клеткам селезенки генов, ответственных за синтез предшественников ДНК по запасному пути. Селекция на НАТ-рре^е позволяет избавиться от миелом-ных клеток и играет ключевую роль ввиду очень малого выхода процесса гибридизации (один гибрид на 500 тыс. клеток селезенки).
Далеко не все клетки, растущие на НАТ-среде, являются гибри-домами — продуцентами специфических антител. Это связано с тем, что часть лимфоцитов селезенки синтезирует иммуноглобулины неизвестной исследователю специфичности. Кроме того, на первых этапах роста после слияния гибридомы теряют некоторые хромосомы, а вместе с ними и способность к синтезу специфических антител. Поэтому важнейшим этапом получения гибридом является отбор клеток, стабильно синтезирующих антитела к антигену. Тестирование гибридом должно осуществляться на самых ранних стадиях после слияния и предполагает использование таких высокочувствительных методов, как иммуноферментный анализ. Содержание антител в культуральной жидкости на этих стадиях роста клеток составляет 10—100 нг/мл.
Однако выявленные на этой стадии антитела необязательно являются моноклональными. Это обусловлено тем, что в ячейке, где культивируют клетки, может оказаться две и более гибридом, каждая из которых синтезирует свой тип антител. Поэтому следующим шагом после селекции является клонирование гибридом, целью которого является разделение клеток и наращивание отдельных клонов из одной клетки. Клонирование осуществляют двумя основными способами — в полужидком агаре и методом предельных разведений.
При клонировании по первому методу клетки высевают на питательную среду с агаром. Из каждой клетки в течение 8—10 дней вырастают колонии, видимые под микроскопом. Колонии могут быть отобраны из агара пастеровской пипеткой и перенесены в жидкую питательную среду для микротитрования таким образом, чтобы одна клетка попадала в каждые 3—6 лунок. Клоны, синтезирующие антитела нужной специфичности, сначала переносят в лунки больших размеров, а затем наращивают в специальных флаконах для культивирования. Важной особенностью клонирования является то, что оно позволяет не только избавиться от клеток, потерявших способность синтезировать антитела, но и позволяет отобрать клоны нужной специфичности со стабильными наследственными свойствами. Основным критерием моноклон альности
165
гибридомных антител является постоянство положения соответствующих моноклональным антителам белковых зон на изоэлектро-фореграммах после многократного клонирования.
Гибридомы, выращиваемые в сосудах для культивирования, синтезируют 5—10 мкг антител на 1 мл среды. При использовании специальных микроносителей типа «Биосилон», выпускаемых фирмой Нунк, количество антител увеличивается до 100 мкг/мл.
• Важнейшим свойством гибридом, унаследованным от миелом-ных клеток, представляется их способность давать асцитные опухоли при введении мышам и синтезировать при этом до 15 мг антител на 1 мл асцитной жидкости.
Химическая модификация молекулы антитела при получении конъюгатов в некоторых случаях может приводить к уменьшению констант связывания в 10 раз и более. Это послужило одним из стимулов для получения гибридных моноклональных антител, содержащих два различных антигенсвязывающих центра, один из которых направлен к определенному антигену, а другой — к ферменту, используемому в качестве метки. Можно ожидать, что гибридные моноклональные антитела окажутся ценным терапевтическим средством, поскольку одновременно позволяют вводить в организм лекарственные соединения и осуществлять их направленный транспорт.
Первой стадией при создании гибридных моноклональных антител является получение обычной гибридомы, синтезирующей моноклональные антитела желаемой специфичности к одному из двух антигенов. Затем гибридому адаптируют к росту в присутствии 8-азогуанина и отбирают те клетки, которые способны размножаться на НАТ-среде. Эти первичные гибридомы, выступающие в роли миеломного партнера, подвергают слиянию с иммунными лимфоцитами мышей, иммунизированных вторым антигеном. В результате слияния и отбора получают дочерние (вторичные) гибридомы, способные синтезировать антитела двойной специфичности. Таким способом были получены гибридные моноклональные антитела, которые одновременно связывались с кислой фосфатазой простаты человека и поверхностным антигеном гепатита В. Гибридные антитела оказались стабильными в процессе хранения, не изменяли своей двойственной специфичности и обладали достаточно высокими константами связывания по отношению к обоим антигенам. Гибридные антитела, взаимодействующие с пероксидазой и соматотропи-ном, были успешно использованы для изучения локализации сома-тотропина в клетке.
В настоящее время в основном получают гибридомы, синтезирующие моноклональные антитела мышиных или крысиных изотипов. Выбор животных определяется наличием соответствующих миелом-ных линий. Однако мышиные моноклональные антитела не всегда можно применять в медицинских целях. Для получения изотипов человека были сделаны попытки гибридизации крысиных миелом с
