Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Первичный отбор антисывороток проводят на основании нахождения их титра, который представляет собой интегральный параметр, характеризующий взаимодействие с антигеном. Более детальные сведения о сыворотке получают, определяя аффинность н концентрацию антител. Следующий этап — это установление антигенной специфичности антител, т. е. возможности взаимодействовать со структурно сходными антигенами.
Принципиальное различие этих этапов заключается в следующем: при определении титра исследуют связывание выбранной концентрации антигена при различных разведениях .антисыворотки. При определении аффинности и концентрации антител исследуют связывание антисыворотки (в определенном разведении) с различными концентрациями меченого антигена. При изучении специфичности антисывороток в соответствующем разведении и при постоянной концентрации меченого антигена добавляют различные концентрации перекрестно реагирующего антигена.
Во всех случаях используют концентрации антигена либо близкие к минимально детектируемым в данном виде анализа, либо в том диапазоне, который соответствует их концентрации в образце.
Определение титра антисыворотки. Титр — это эффективная величина, характеризующая связывающую способность антител, зависящая от их концентрации и аффинности. Абсолютное значение титра также зависит от метода и условий проведения эксперимента (температуры, времени, pH и т. д.) и от начальной концентрации свободного антигена.
Количественно титр находят как предельное разведение сыворотки, при котором еще наблюдается положительный регистри-
157
руемый данным методом эффект взаимодействия антисыворотки с антигеном. Например, если титр устанавливают методом преципитации свободного антигена в геле и для первой сыворотки образование преципитата наблюдается при разведении в 2т раза, а для другой — в 2" раз (тп>п), то титр первой сыворотки равен 2т, а второй —2", причем вторая антисыворотка менее активная, чем первая. Иногда оперируют понятием «50%-ный титр», подразумевая под этим, соответственно, разведение сыворотки, вызывающее 50%-ное связывание антигена. <гРабочим титром» называют то начальное разведение сыворотки, которое используют непосредственно в эксперименте.
Таблица 5.2. Схема тестирования сывороток
Этап исследования Условия Цель
Титр Аффинность Специфичность [Аг *] — постоянна [Ат] — варьирует [Ат] — постоянна (рабочий титр) [Аг *] — варьирует [Ат] — постоянна [Ari*] —постоянна [Аг2] — варьирует (перекрестный) Отбор высокоактивных иммунных антисывороток, определение конечного и рабочего титра Оценка аффинности и концентрации фракции высокоаффинных антител Определение специфичности антител
где [Ат], [Аг *] и [Аг2] —соответственно концентрации антител, меченого антигена и нерекрестно реагирующего антигена
Титр антисыворотки сильно зависит от концентрации антигена, используемого для тестирования и от способа его определения. Например, одна и та же сыворотка может иметь титр 100 в тесте иммунопреципитации и 100 000 в тесте иммуноферментного анализа. Поэтому при тестировании сыворотки и определении титра лучше всего применять тот же метод, что и при анализе, а концентрацию антигена выбирать близкую к минимальной в том диапазоне, который выбран для анализа. Кроме того, следует учитывать, что в иммуноферментном анализе используют как гомогенные, так и гетерогенные методы определения концентрации антигена, которые могут сильно отличаться по структуре образующихся иммунных комплексов. В частности, в твердофазных методах вероятность образования циклических комплексов антиген — антитело значительно меньше, чем в гомогенных, а следовательно, и наблюдаемая аффинность антител в обеих системах будет разная.
При разработке методов ИФА обычно пользуются значением титра антисыворотки, определенным в непрямом методе, в котором на стенках лунок микроплаты первоначально сорбируют ан-
158
тиген и затем изучают связывание с ним иммунной сыворотки в последовательных разведениях. Связывание исследуемых антител с иммобилизованным антигеном регистрируют с помощью антиви-дового конъюгата к иммуноглобулиновой фракции сыворотки животного, используемого для иммунизации.
Результаты в этом случае обычно оценивают с помощью понятия «50%-ный титр». На рис. 18 приведены кривые титрования антисывороток к инсулину, полученных иммунизацией морских свинок. Максимальный сигнал, регистрируемый по оптической плотности А продукта реакции окисления перекисью водорода 5-аминосалициловой кислоты, составляет —-1,4 оптических единиц. За титр сыворотки принимается ' такое разведение, при котором оптическая плотность, регистрируемая в ИФА, имеет значение, близкое к 0,7.
Обычно такой подход используется в качестве
1-го этапа оценки качества полученных иммунных сывороток и позволяет отобрать высокоактивные иммунные сыворотки. Однако для более глубокой оценки полученных антител проводят определение их аффинности. При разработке методов ИФА ряда антигенов, присутствующих в биологических жидкостях в низких концентрациях порядка 10_ш—10ПМ (например, инсулин и другие полипептидные гормоны), должны быть использованы антисыворотки, имеющие не только высокий титр, но и достаточное содержание антител, обладающих высокой константой связывания (высокоаффинных антител).
