Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Получение антисывороток и поликлональных антител
Процесс введения животному антигена по разработанной схеме называется иммунизацией, а сыворотка крови иммунизированных животных — антисывороткой. В литературе описано большое разнообразие способов иммунизации, зависящих от структуры антигена, его доступных количеств, вида животного и т. д. По этим причинам условия получения иммунных сывороток подбираются эмпирически. Тем не менее имеются общие закономерности, которые позволяют выбрать условия получения высокоактивных антисывороток.
§ 1. Иммуногенность антигенов
Иммуногенность антигена—это способность
• ь а ооагнизме иммунизированного животного образование антител. Иммуногенность как биологическое свойство антигена является более сложным, чем антиген-ность. Антигенности того или иного вещества недостаточно, чтобы вызвать образование антител. В качестве примера можно привести гаптены, которые приобретают иммуногенность только после конъюгирова-ния с соответствующим носителем.
Иммуногенность веществ сильно зависит от их молекулярной массы: чем выше молекулярная масса, тем выше иммуногенность. Отсюда вытекает важное практическое следствие — сшивка биополимеров (белков, полисахаридов) между собой и другими белками повышает иммуноген-
ность. Зависимость иммуногенности от молекулярной массы, по-видимому, определяется следующими причинами: во-первых, увеличением времени пребывания антигена в организме при возрастании его молекулярной массы; во-вторых, у высокомолекулярных антигенов существенно возрастает способность взаимодействовать с макрофагами, в-третьих, с увеличением молекулярной массы в антигене увеличивается как общее количество антигенных детерминант, так и их разнообразие, что повышает эффективность взаимодействия антигенов как с В-, так и с Т-лимфоцитами.
Плотность расположения и количество антигенных детерминант на поверхности антигенов также имеет важное значение: по мере увеличения этих показателей иммуногенность в начале растет, а затем начинает уменьшаться. Так, например, для динитро-фенильной гаптеновой группы было показано, что из конъюгатов, содержащих 3, 16 и 28 групп на молекулу бычьего альбумина, максимальной антигенностью обладал конъюгат, содержащий 16 молекул гаптена. Одной из причин такого эффекта, по-видимому, является сложность межклеточной кооперации. В частности, показано, что в иммунном ответе против антигенов, имеющих повторяющиеся антигенные детерминанты (полисахариды, искусственные антигены), участвуют только В-лимфоциты; такие антигены называются Т-независимыми. Для этих антигенов, например полимеров D-аминокислот, также характерно снижение скорости метаболизма в организме.
Очень важным является понятие <гчужеродность» иммуногена. Установлено, что чем более антиген отличается по своей структуре от гомологичного антигена иммунизируемого животного, тем выше его иммуногенность. Например, инсулины человека и многих видов животных имеют близкую первичную структуру и поэтому для них инсулин человека малоиммуногенен. Однако между инсулином человека и морской свинки имеются достаточные отличия, что позволяет использовдть этих животных как продуцентов соответствующих антисывороток (рис. 17).
Однако это правило нельзя считать абсолютным. Так, например, гормон тироксин имеет одинаковую структуру у всех животных, тем не менее, будучи конъюгированным с подходящим белком, он становится хорошим иммуногеном. В данном случае антигенная детерминанта состоит не только из гормона, но и «ножки» и части белковой глобулы, что в целом создает «чужеродную» структуру. Именно на этом принципе основано получение антител Против различных низкомолекулярных физиологически активных веществ.
«Чужеродность» зависит от генетических особенностей иммунизируемого животного, поэтому часто иммуногенность связывают с генетической чужеродностью антигена. Из «чужеродности» следует, что иммуногенность — это не абсолютное свойство антигена по отношению к данному виду животного, а иногда даже к ин-
147
A-цепь В-цепь 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 1213141516171819 20 21 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1415 16 171819 20212223 2425 2627282930
н
и
ей
н
><
Ри
и-
О
ofi
ш
О
СО-и
>
hJ
><
<
ии
>
я
со
tu
С/5-U
Я
О
Z
>
и*
со со S
* *
О
Q
Ш
it J
Z
CJ-40
>-Z ш
O'
>--J
со со—о
со Н
и—СО
-о O' ш > о
>
*
<
>
о
о о
аз
е?
н
?
н
о
11 1
к Л
л У, X я
?s Ю 03 О о о
f ЯИ Д
>. и о а
&- о v о
X ЛЗ *
5 §
О СО
«9 л
1 S S’ s
га
&8
I 8
Рис, 17. Аминокислотная последовательность молекул инсулинов человека и различных животных (L. F. Smith, Ш72)
дйвидуальному организму. Необходимо иметь в виду, что иммунная система организма сама находится под жестким генетическим контролем, который определяет как биологическую активность различных участников иммунного процесса, так и многообразие специфичностей рецепторов, а значит, и специфичностей антител. Именно видовая и индивидуальная вариабельность организмов требует внимательного выбора вида животного. Чем менее «чужеродный» антиген, тем большее количество животных следует брать для иммунизации. Так, например, для получения антисывороток против инсулина наиболее иммунореактивными являются морские свинки, при этом в среднем только одна из семи морских свинок дает удовлетворительную для целей анализа антисыворотку. Даже в случае получения антисывороток против достаточно «чужеродных» антигенов необходима большая группа животных, так как в этом случае нивелируются индивидуальные различия. Смесь антисывороток против данного антигена о г разных животных одной группы называют пулом.
