Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика имуноферментного анализа" -> 52

Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика имуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaimuntoferniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 46 47 48 49 50 51 < 52 > 53 54 55 56 57 58 .. 115 >> Следующая

137
для определения иммуноглобулина Е человека имеет нижний предел детекции в этой' системе 2,6 IU/мл (для фотометрического варианта 3,6 IU/мл) и коэффициент вариации — 3,9—13% (табл. 4.9).
В настоящее время реакция двухсубстратного пероксидазного окисления использована во многих вариантах твердофазного ИФА с применением различных носителей и фотодетекторов (фотоумножителей, кремниевых фотодиодов). Показано, что удовлетворительные результаты могут быть получены с применением очень
Таблица 4.9. ИФА на основе реакции усиленной хемилюминесценции пероксидазного окисления люминола Н202 в присутствии второго субстрата
Определяемое соединение Конъюгат Второй субстрат (усилитель) Предел обнаружения
Антитела к вирусу краснухи Ат-ПХ * Люциферин _
IgE Ат-ПХ » 10 Ш/мл
л-Йодфенол 10 IU/мл
Дигоксин Аг-ПХ Люциферин 0,5 нг/мл
Аг-ПХ я-Йодфенол 0,3 нг/мл
Раковоэмбриональный анти- Ат-ПХ » 3 нг/мл
ген
Хорионический гонадотропин Ат-ПХ » 5 IU/мл
Фактор VIII Ат-ПХ » 0,2 Щ/мл
* ПХ — пероксндаза.
простых устройств, позволяющих регистрировать световое излу-чение на фотопленках. Большое внимание уделено изучению геометрии носителей, обеспечивающих удовлетворительную регистрацию светового излучения по конечной точке. На основе твердофазного ИФА на нитроцеллюлозных дисках разработан быстрый метод обнаружения антител с регистрационной системой на по-ляроидной пленке. Метод применяется для определения антител к малярии, цитомегаловирусу. Продолжительность определения около 30 мин.
Таким образом, имеющиеся в настоящее время данные позволяют считать, что хемилюминесцентная система, основанная на совместном окислении люминола и второго усиливающего субстрата перекисью водорода, может рассматриваться как одна из наиболее перспективных систем детекции взаимодействия антиген — антитело.
Хемилюминесцентный иммуносубстратный анализ. Другим направлением в ХИА является использование в качестве маркеров субстратов хемилюминесцентных реакций — аминофталгидразидов (АФГ). Эти соединения детектируются на уровне пикомолей в течение очень небольших промежутков времени (0,3—2 с), отли-
138
чйются стабильностью и могут быть использованы для разработки как гетерогенных, так и гомогенных методов ИФА.
Нижний уровень детекции производных-изолюминола составляет 1—5 пмоль. Как правило, производные изолюминола, конъюгированные с антигенами и антителами, имеют более низкий квантовый выход, что приводит к снижению чувствительности детекции. Люминол, изолюминол, производные люминола и изолюминола используются в качестве маркеров широкого круга соединений: белков, белковых и стероидных гормонов, лекарственных соединений и др.
О Почти все методы иммобилизации хемилюминесцентных меток включают следующие три основные стадии: 1) химическую активацию хемилюминесцентного маркера; 2) химическую модификацию белка или гаптена; 3) ковалентное связывание с помощью бифункционального реагента.
Общая структура обычно используемых хемилюминесцентных конъюгатов со стероидами и белками имеет вид
(и = 2—6)
белок
\
NH
СО—(СН2)2—СО—NH
Известно большое количество методов для получения конъюгатов с люминолом. Часть методов включает стадию образования активных альдегидных групп при окислении углеводных остатков и гаптенов перйодатом натрия. Активные альдегидные группы на молекуле* белка реагируют с ароматической аминогруппой с образованием основания Шиффа. Для ковалентного связывания люминола с модифицированными белками и гаптенами используют также глутаровый альдегид и карбодимиды.
Квантовый выход хемилюминесценции люминола, связанного с белковой глобулой в реакции окисления перекисью водорода, катализируемой гемином (pH 13,5), составляет 0,3%. Данные по использованию люминола в качестве метки приведены в табл. 4.10.
Значительно более широкое применение в качестве маркеров получили производные изолюминола. Описано использование конъюгатов с производным изолюминола—[N-аминобутил- (N-этил) -
139
изолюминолом (ABEI)] для определения белков, ряда белковых гормонов — хорионического гонадотропина человека, лютеинизи-рующего гормона, фоллйкулстимулирующего гормона и пролакти-на. Определение ведется с помощью методов иммуноанализа, основанных на применении: 1) меченых антигенов в конкурентном анализе; 2) меченых вторых антител {универсальный реагент в конкурентном варианте); 3) меченых первых антител («сэндвичи-модификация).
Таблица 4.10. Использование конъюгатов на основе люминола в хемилюминесцентном иммуноанализе
Определяемое соединение Предел обнаружения, М Коиъюгат/люмииесдеитиая система
Тестостерон ю-9 Люмннол-Аг/Си-ацетат/Н202
IgG кролика 5-Ю-9 Люминол-Ат/К'аОО/НгОг
IgG человека 5-10-8 Люмииол-Аг/гемин/Н202
Дигоксин 8-10-11 Люминол-Аг/гемоглобин/НгОг
Инсулин 2 • 10 ~9 Люмннол-Аг/ЫаОС1/Н2С)2
Тироксин 7-10-9 Диазолюминол-Ат/МПХ/Н202 *
Тироксинсвязывающий глобулин Ферритин 10-6 Диазолюминол-Аг/МПХ/Н202
10-7 Диазолюминол-Ат/МГ1Х/Н202
С-реактивный белок * МПХ — микропероксидаза. ю-6 Диазолюминол-Ат/МПХ/Н202
Конкурентный иммуноанализ применен для количественного определения хорионического гонадотропина человека в сыворотке крови и моче и лютеинизирующего гормона в моче. Описан «сэнд-вич»-метод для определения антител к иммуноглобулину человека. В качестве твердой фазы использовали 96-луночные микропланшеты из поливинилхлорида, регистрация результатов реакции осуществлялась автоматически.
Предыдущая << 1 .. 46 47 48 49 50 51 < 52 > 53 54 55 56 57 58 .. 115 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed