Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика имуноферментного анализа" -> 50

Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика имуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaimuntoferniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 44 45 46 47 48 49 < 50 > 51 52 53 54 55 56 .. 115 >> Следующая

Особенно большой интерес в последнее время вызывают реакции пероксидазного окисления люминола. Помимо пероксидазы (ПХ) в качестве катализатора может выступать фрагмент цитохрома С — гемин с 11 аминокислотными остатками, получивший название микропероксидазы (МПХ).
В литературе описано большое количество модификаций иммуноанализа с маркерами, детектируемыми в хемилюминесцентных реакциях. Классификация их, как правило, осуществляется в соответствии с типом метки. Маркером в методах хемилюминес-центного иммуноферментного анализа (ХИФА) является катализатор-фермент, в методах хемилюминесцентного иммуносубстрат-ного анализа (ХИСА) — молекулы субстратов.
Хемилюминесцентные методы иммуноферментного анализа. Использование катализаторов в качестве маркеров в люминесцентном иммуноанализе является наиболее перспективным направлением, поскольку относительно катализатора реакции квантовый выход гораздо выше, чем относительно субстрата, и, следовательно, этот подход принципиально позволяет повысить чувствительность метода.
В последнее время изучен ряд хемилюминесцентных реакций, имеющих достаточно низкое фоновое свечение, что позволяет использовать их для разработки простых и практически удобных модификаций ИФА, с помощью которых осуществляют регистрацию, основанную на накоплении хемилюминесцентного сигнала. Первые работы по ХИФА базировались на применении конъюгатов с пероксидазой, детекцию которой осуществляли в реакциях окисления люминола или пирогаллола.
• Интерес к изучению этого фермента в качестве маркера в ХИФА можно объяснить: 1) доступностью фермента в очищенном виде; 2) относительной простотой методов получения конъюгатов пероксидазы с антителами и антигенами различной структуры;
133
3) высокой чувствительностью детекции пероксидазы в хемилю-минесцентных реакциях окисления АФГ (10~12 М).
Данные по применению пероксидазы в качестве маркера и детектирующей системы, основанной на реакциях окисления люми-нола и пирогаллола, представлены в табл. 4.7.
Реакция окисления пирогаллола проводится при близких к нейтральным значениях pH (pH 6,5), квантовый выход реакции составляет 10~5—10-б%. Чувствительность определения фермента этим методом составляет около 10-9 М. Исследования по люминесцентному ИФА, основанные на реакции окисления люминола, можно разделить на две основные группы: 1) определение фермента проводится в слабощелочной среде; 2) реакция окисления люминола Н202 проводится в щелочных условиях (pH 12—13).
Таблица 4.7. Хемилюминесцентный иммуноферментный метод на основе реакции окисления люминола Н2О2
Определяемое соединение Предел обнаружения, М Коиъюгат/люминесцеитиая система
Человеческий сывороточный 5-Ю-9 ПХ * — Ат/люминол/перборат
альбумин (ЧСА)
Анти-ЧСА-антитела ю-9 ПХ — Ат/алюминол/перборат
IgG кролика 5-Ю-9 Протогемин — Ат/люминол/пер-
Иммуноглобулины лимфоци- _ борат ПХ-Ат/люминол/Н202
тов
Кортизол 1 • 10~п ПХ — Аг/люминол/Н202
Антиген бактериальных кле- — ПХ — Ат/пирогаллол/НгОг
ток
Бактериальный энтеротоксин I0-9 ПХ — Аг/пирогаллол/Н202
Вирусные антигены — ПХ/Ат/пи рога л лол/Н202
* ПХ — пероксндаза.
Важным вопросом является выбор оптимальных условий реакции окисления люминола Нг02 в присутствии пероксидазы, обеспечивающих высокую чувствительность определения фермента.
Сравнительное изучение катали тических свойств пероксидазы и гемина показало, что гемин является более эффективным катализатором, чем пероксидаза, и его каталитическая активность возрастает в щелочных условиях (pH 11—12). Вследствие этого наиболее высокие значения интенсивности хемилюминесценции в случае катализатора ПХ также наблюдаются при значениях pH 12— 13, так как в этих условиях осуществляется диссоциация пероксидазы на гемин и апофермент. Однако при этом наблюдается достаточно сильное фоновое окисление люминола, катализируемое
134
ионами металлов. Максимальная разница между значениями сигнала и фона достигается в растворах pH 11—12. Для достижения высокой чувствительности определения фермента необходим строгий контроль чистоты используемых реагентов. Предел обнаружения пероксидазы в оптимальных условиях составляет 10-12 М.
В слабощелочной среде уровень фоновых реакций значительно ниже, однако значительно ниже каталитическая активность фермента.
Точность и воспроизводимость ХИФА существенно определяется степенью диссоциации пероксидазы на гемин и апофермент, т. е. важным фактором, повышения чувствительности и точности метода является выбор условий для полной диссоциации ПХ на гемин и апофермент. Даже в сильнощелочных растворах процесс диссоциации осуществляется в течение 5—10 мин. Возможно использование додецилсульфата натрия, разрушающего белковую глобулу фермента, вследствие чего скорость диссоциации фермента увеличивается в 3 раза и улучшается воспроизводимость результатов. Этот подход был применен для определения тироксина и вируса X картофеля.
Еще одно направление развития люминесцентного анализа связано с использованием в качестве маркеров непосредственно самого гемина, родственных ему соединений и металлофталоциани-нов.
Предыдущая << 1 .. 44 45 46 47 48 49 < 50 > 51 52 53 54 55 56 .. 115 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed