Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
128
что является достаточным для модификации АТР таким образом, что кофактор теряет субстратную специфичность к светляковой люциферазе. Гетерогенные методы ЛИКА позволяют пренебречь влиянием эндогенного АТР на определение интенсивности излучения.
При использовании систем на основе бактериальной люцифера-зы необходимо принимать во внимание ее многокомпонентность. Условия проведения эксперимента должны быть выбраны таким образом, чтобы примеси дегидрогеназ, оксидоредуктаз, имеющиеся в образцах и реагентах, не оказывали влияния на детектирующую систему, не нарушили концентрационных соотношений в сложной полиферментной системе бактериальной биолюминесценции.
В последнее время предложен очень интересный подход, позволяющий обойти недостатки, связанные с многокомпонентностью систем. Суть его состоит в том, что полиферментная система, используемая в качестве детектирующей, соиммобилизуется на одном носителе, вследствие чего скорость реакции в такой системе существенно возрастает по сравнению со скоростью этой же реакции в растворе. Этот эффект объясняется повышением концентрации реагирующих соединений на носителе и уменьшением диффузионных затруднений, которые важны при проведении реакции в растворе и значительно снижаются при соиммобилизации всей ферментативной системы на носителе. Предложенный подход позволяет значительно повысить эффективность работы детектирующей системы по сравнению с полиферментной системой, присутствующей в образце (растворе). Такой вариант метода получил название «туннельного». Вклад химического «шума», вносимого образцом, в таком случае пренебрежимо мал.
Использование метода ЛИКА на основе светляковой люцифе-разы в существенной мере ограничено труднодоступностью самого препарата фермента. В этой связи большой интерес представляют исследования по генной инженерии люциферазы светляков. Разработка и внедрение новой технологии получения препарата люциферазы с субстратной специфичностью к АТР обеспечит возможность широкого практического использования этой высокочувствительной гомогенной модификации иммуноанализа.
Биолюминесцентный иммуноферментный анализ (БИФА). В этой группе методов можно выделить методы, основанные на использовании в качестве меток люцифераз (светляков и бактерий) и методы с маркерами — ферментами, участвующими в реакциях, сопряженных с люминесцентными системами. В табл. 4.G приведены имеющиеся модификации БИФА ряда антигенов.
Несмотря на высокую чувствительность, достигаемую в БИФА, существуют трудности синтеза конъюгатов, связанные с инактивацией фермента. Процесс синтеза требует пристального внимания к деталям эксперимента, защиты активного центра фермента в процессе его ковалентного связывания с антигеном, что существенно
129
ограничивает использование люцифераз в качестве маркеров. В этой связи большой интерес представляет подход, основанный на возможности обратимой инактивации фермента, достигаемой модификацией существенного «особого» аминокислотного остатка активного центра фермента. Для осуществления обратимой инак-
Таблица 4.6. Биолюминесцентные иммуноферментные методы анализа
Определяемое соединение Конъюгат Источник люцнферазы Предел обнаружения в образце
2,4-ДНФ-лей- 2,4-ДНФТНТ/люцифераза Светляки 2,5 пмоль
цин тринитро- светляков 1.0 пмоль
толуол (ТНТ) 2,4-ДНФТНТ/глюкозо-6-фос- Бактерии 0,01 пмоль
2,4-ДНФ-лей- фатдегидрогеназа 2,4-ДНФ/люцифераза светля- Светляки 10 пмоль
цин ков 2,4-ДНФ/люцифераза бактерий Метотрексат/люцифераза Бактерии 15 пмоль
Метотрексат Светляки 2,5 пмоль
светляков Метотрексат/люцифераза бактерий Инсулин/люцифераза бактерий Эстриол/люцифераза бактерий Т ироксин/пируваткиназа Бактерии 2,5 пмоль
Инсулин » 0,5 пмоль
Эстриол » 50 пг
Тироксин Светляки 10 пмоль
тивации люциферазы бактерий предложено использование метил-алкантиосульфонатов. Схема анализа в общем виде может быть представлена следующим образом:
О
(активная форма) || (неактивная форма)
люцифераза — SH-f-CH3—S—S— (СН2)„ —антиген ->-люцифераза —
О
(активиая форма)
— S — S —(СН2)л— антиген Восстанавливающий__^ ЛЮЦИферЭЗЭ — SH
агент
Модифицированный метилалкантиосульфонатом антиген инактивирует люциферазу, связываясь с цистеиновым остатком (Cys 106 а-субъединицы) активного центра. На определенной стадии иммуноанализа, требующей количественного определения маркера, S — S-связь между модифицированным антигеном и активным центром фермента восстанавливается действием тиоловых агентов, при этом реактивированный фермент выходит в раствор, где его активность легко измеряется.
130
Заслуживает внимания еще один подход, когда в качестве маркеров антигена или антитела используют ферменты, катализирующие реакции с образованием АТР и NAD. Использование биолю-минесцентных систем для регистрации генерируемого в процессе реакции кофактора значительно повышает чувствительность определения фермента-маркера и, следовательно, чувствительность соответствующего метода анализа. Общая схема детектирующей системы может быть представлена следующим образом:
АТР, NAD-генерирующие ферменты
