Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
1?в
равновесия, высвобождению связанного конъюгата, восстановлению интенсивности излучения, которая пропорциональна концентрации свободного гаптена.
Описанный метод является гомогенным, поскольку не требует стадии разделения прореагировавшего и непрореагировавшего конъюгата.
Эффект стерического исключения кофактора наблюдается не только для низкомолекулярных гаптенов, но и для более сложных по структуре молекул, например белкового гормона инсулина.
О Гомогенный тип и простота метода ЛИКА позволяют использовать его для экспресс-анализа антител, оценки связывающей способности иммунных сывороток. Действительно, степень ингибирования светового излучения конъюгата кофактор — антиген гомологичной иммунной сывороткой пропорциональна концентрации в ней антител и определяется их константой связывания. Анализируя ряд сывороток в одних и тех же разведениях, можно достаточно быстро оценить и сравнить их связывающую способность.
Установлено, что ковалентное связывание АТР с инсулином не изменяет его антигенных свойств, что, по-видимому, объясняется как небольшими размерами самого маркера, так и его удаленностью от молекулы антигена. Эго обстоятельство обеспечило возможность использования ЛИКА для решения ряда проблем: сравнительного изучения физико-химических свойств растворимых и иммобилизованных антител, исследования физико-химических характеристик антител на разных стадиях иммунного ответа, изучения структуры иммунных комплексов при разных соотношениях концентраций компонентов реакции антиген — антитело. Большой интерес к использованию этого подхода объясняется возможностью проведения реакций в растворе без введения твердой фазы, высокой чувствительностью метода, позволяющего работать в области физиологических концентраций инсулина.
Наряду с гомогенным вариантом ЛИКА на основе конъюгатов АТР — антиген известны гетерогенные модификации. Описано применение ЛИКА для количественного определения тироксина и мио-глобина. Способ проведения анализа в этом случае включает стадии взаимодействия конъюгата с иммобилизованными антителами и отмывкй. Затем связь между антигеном и АТР гидролизуется слабой кислотой, молекула интактного АТР поступает в раствор, где ее определяют с помощью люциферазы светляков.
Системы детекции, использующие бактериальную люПтиферазу, основаны на применении конъюгатов производных NAD и гаптенов (антигенов) (табл. 4.5).
Биотин и 2,4-ДНФ связывали ковалентно с аминогруппой нико-тинамид-6 (2-аминоэтиламино) пуриндинуклеотида (AENAD) для получения ферментативно активных конъюгатов—биотин AENAD и 2,4-ДНФ — AENAD. После восстановления кофактора в реакции с этанолом, катализируемой алкогольдегидрогеназой:
127
2,4-ДНФ—AENAD + этанол алкогольдегидрогеиаза , 2,4 =
= ДНФ — AENADH -f- ацетальдегид
AENADH определяли в реакции с бактериальной люциферазой из Photobacterium fisheri. Интенсивность светового излучения биотин — AENAD и 2,4-ДНФ — AENAD ингибировалась специфическим связыванием с авидином и антителами к 2,4-ДНФ соответственно. Высокая чувствительность детекции кофактора в этой системе достигается благодаря использованию сопряженных ферментативных реакций, осуществляющих регенерацию NAD. Модифицированный NAD нашел использование в качестве метки при определении стероидов. Конъюгат для проведения анализа получали ковалентным связыванием активированного карбоксильного производного стероида с AENAD с последующей очисткой методом высоковольтного электрофореза. Коферментативная активность, определенная в реакции с люциферазой бактерий, составила 5—10 % от активности интактного кофактора. Антигенные свойства стероидов при взаимодействии с гомологичными антителами сохранялись.
Для определения эстриол-16 а-глюкоронида (Э3-16а-Г) разработан гомогенный биолюминесцентный метод, основанный на использовании конъюгата Э3-16 а-Г — NAD. Для восстановления метки применяли глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, катализирующую реакцию превращения глюкозо-6-фосфата в D-глюконо-б-лактон-б-фосфат:
D-глюкозо-б-фосфат -[- Эз-16а-Г —
— AENAD глюкозо-6-фосфатдегндрогеназа ^ D-ГЛЮКОЗО-б-ЛаКТОН-б-фОсфаТ-Ь
+ Э3-16а-Г —AENADH
Концентрацию конъюгата определяли с помощью люциферазы бактерий. Однако использование этого метода для установления Эз-16а-Г в моче встретило ряд ограничений, связанных, прежде всего, с влиянием других компонентов мочи на биолюминесцентную систему. Включение в схему анализа стадии взаимодействия с иммобилизованными антителами с последующей отмывкой комплекса антиген — антитело от несвязавшихся компонентов образца и введение агентов, расщепляющих комплекс антиген — антитело для перевода восстановленного кофактора в раствор, существенно улучшили чувствительность метода.
• Недостатки гомогенного метода ЛИКА — это недостатки, присущие любому гомогенному варианту иммуноанализа. К ним следует прежде всего отнести влияние на результат анализа эндогенных примесей в образце и в самих реагентах. Использование АТР и NAD в качестве маркера требует удаления примесей этих кофакторов из препаратов антител (иммунных сывороток) и из образца. Для удаления АТР может быть использована обработка образца биологической жидкости раствором Nal0.4 в тёчение 10—15 мин,
