Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
§ 7. Гомогенные методы ИФА
К гомогенным относятся методы ИФА, осуществляемые в однофазной системе и не требующие стадии механического разделения образовавшихся комплексов. Эти методы, в основном, базируются на эффекте модуляции антителами активности фермента (или кофактора), используемого в качестве метки.
Все известные в настоящее время схемы проведения гомогенного ИФА относятся к типу II приведенной в начале гл. 4 классификации, т. е. во всех схемах регистрируется концентрация не образующегося специфического комплекса антитело — антиген, а оставшихся свободными центров специфического связывания. Однако, в противоположность гетерогенным схемам, наблюдаемая ферментативная активность, соответствующая концентрации незанятых мест специфического связывания, может как уменьшаться, так и увеличиваться, что обусловлено различной природой воздействия связывания лигандов на ферментативную активность.
Так же как и в случае гетерогенных методов, разнообразие гомогенных вариантов анализа обусловлено цозможностью введения метки как в молекулу антигена, так и в молекулу антитела. Кро-
ме того, по сравнению с гетерогенным ИФА гомогенный оперирует более широким кругом соединений, используемых в качестве метки. Кроме ферментов в нем применяют компоненты или эффекторы ферментативных реакций, такие, как кофакторы, ингибиторы, про-стетические группы, субстраты. Таким образом, схематическое разделение гомогенных методов может быть представлено следующим образом (схема 4.4):
Схема 4.4
Введение метки в молекулу антигена является одним из наиболее распространенных подходов в гомогенных методах ИФА. Эти методы относятся к конкурентным и основаны на одновременном взаимодействии с антителами анализируемого и меченого антигенов. После образования в растворе соответствующего иммунохи-мического комплекса проводят измерение ферментативной активности, которая пропорциональна концентрации свободного или связанного меченого лиганда.
Необходимым условием гомогенного ИФА является изменение наблюдаемой ферментативной активности при взаимодействии меченого антигена с антителами. Механизмы модуляции активности мог.ут быть различными. К основным из них относятся следующие:
1) исключение субстрата из ферментативной реакции вследствие стерического затруднения взаимодействия субстрата с ферментом, возникающего при образовании иммунохимического комплекса меченого антигена с антителами;
2) индуцируемое антителами конформационное изменение структуры молекулы фермента-метки, приводящее к изменению ферментативной активности;
3) модуляция антителами способности кофакторов, субстратов, ингибиторов и других соединений участвовать в ферментативной реакции.
Методы анализа антигенов, основанные на использовании меченных ферментом антигенов. Стерическое исключение субстрата. На этом принципе был основан первый гомогенный метод ИФА, разработанный в 1972 г. и вошедший в литературу под названием
115
«EMIT» (англ. enzyme multiplied immunoassay technique). Суть его состоит в следующем. Низкомолекулярный антиген ковалентно связывают с ферментом лизоцимом вблизи активного центра. В комплексе с антителами активный центр фермента становится стерически недоступен макромолекулярному субстрату, которым являются стенки бактериальных клеток. Схема метода может быть представлена следующим образом:
При увеличении концентрации определяемого антигена концентрация неактивного комплекса конъюгата с антителами снижается, а следовательно, возрастает регистрируемый параметр ферментативной реакции. На основе данного подхода были разработаны наборы для определения широкого круга наркотических и лекарственных средств.
О Существенным достоинством EMIT-анализа является экспресс-ность определения, которая составляет 2—5 мин. К недостаткам метода следует отнести меньшую чувствительность, чем в гетерогенном ИФА (~ 1 мкг/мл), и возможность определения только низкомолекулярных антигенов.
Принцип стерического исключения субстрата был использован также для разработки метода определения макромолекулярных антигенов, таких, как альбумин, иммуноглобулины G и М. В анализе используют конъюгат антигена с p-D-галактозидазой Е. coli. После образования комплекса с антителами активный центр фермента становится недоступным для взаимодействия с искусственно синтезированным макромолекулярным субстратом о-нитрофенил-P-D-гатактозидом, ковалентно связанным с водорастворимым полимерным декстраном. В присутствии антигена «степень ингибирования» фермента уменьшается пропорционально концентрации исследуемого соединения. Метод позволяет измерять IgG в микро-граммовых количествах в течение нескольких минут.
Индуцируемое антителами изменение активной конформации фермента. Известно, что в результате комплексообразования антител с антигенами в молекулах реагирующих соединений могут про-
116
исходить конформационные изменения. Такие же структурные изменения в молекулах ферментов могут наблюдаться при связывании антител с конъюгатами антиген — фермент. Если в результате такого взаимодействия фермент переходит в другую конформацию, при которой его каталитическая-активность сильно меняется, то это явление может быть положено в основу методов гомогенного ИФА.
