Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
109
-о >-© I-о+ >— -о >-© >-©
о>-© -о>—
| 0У~®
2) отмывка
>-0
ферментативной
активности
^ ^ определение
^ ЖпПМ О ЦТ qtuquaC
toy®
Отличием такого подхода от уже рассмотренных схем является определение ферментативной активности не на носителе, а в растворе путем введения в соответствующий канал субстратов фермента и последующей регистрации продукта ферментативной реакции в проточной кювете спектрофотометра.
О Большинство методов ИФА основано на фотометрическом, флу-ориметрическом, люминесцентном или электрохимическом определении продукта ферментативной реакции. Обычно в равновесных анализах стадия регистрации ферментативной активности занимает относительно длительный промежуток времени (от 30 мин и более). При сокращении длительности ИФА за счет проведения реакции антиген — антитело в кинетическом режиме необходимо применять быстрые методы детекции ферментной метки, иначе время осуществления ферментативной реакции будет лимитировать время анализа в целом.
Обычно в таких случаях измеряют начальную скорость ферментативной реакции, что при применении современных анализаторов занимает 0,5—2 мин.
Другой путь проведения ИФА в проточных реакторах основан на регистрации теплового эффекта реакции фермент — субстрат с помощью термистера. Определяемый экспериментально тепловой эффект зависит от количества связанного с иммуносорбентом ферментного конъюгата, которое в свою очередь зависит от начальной концентрации исследуемого соединения. На примере человеческого сывороточного альбумина с использованием его конъюгата с ката-лазой показана возможность определения белка в концентрации 0,1 мМ в течение 10 мин.
Активность многих ферментов (пероксидаза, каталаза, глюко-зооксидаза) может быть измерена электрохимическим путем. В связи с этим значительный интерес представляют иммунофер-
110
ментные электроды, которые являются еще одним аппаратурным решением для твердофазного ИФА в кинетическом режиме.
Принцип работы одного из типов анализатора заключается в следующем. Определяемые и меченные ферментом (каталазой или глюкозооксидазой) антигены конкурируют за центры связывания антител, иммобилизованных на мембране, окружающей кислородный электрод Кларка. После проведения иммунохимической реакции отмывают несвязавшиеся на мембране компоненты исследуемой смеси и вводят растворы субстратов фермента. Измеряемый ток на электроде пропорционален концентрации кислорода, поглощаемого (или выделяемого) в ферментативной реакции, осуществляемой связанным с антителами ферментным конъюгатом. Процедура регистрации иммобилизованных антител позволяет использовать устройство многократно. Время анализа белковых антигенов (альбумин, инсулин) составляет 15 мин при чувствительности 5— 10 мкг/мл. Возможно в качестве меток применять другие ферменты (щелочная фосфатаза, дегидрогеназа и др.), которые образуют электрохимически активные продукты реакции, определяемые в проточных системах.
• Иммуноферментные электроды просты и удобны в работе. Их применение целесообразно для быстрого анализа соединений, не требующего высокой чувствительности.
§ 6. Новые подходы в гетерогенном ИФА
Применение в ИФА антигенов и антител, иммобилизованных на нерастворимых носителях, дает возможность эффективно разделять компоненты аналитической системы перед стадией определения концентрации ферментной метки. Такой подход универсален и может применяться для широкого круга соединений — от гаптенов до микробных клеток. Однако нерастворимые иммуносорбенты имеют и некоторые отрицательные стороны, а именно: 1) возможность неспецифического связывания компонентов с носителем; 2) значительное время анализа (до нескольких часов) из-за длительности реакции антиген — антитело, определяемое низкой концентрацией иммобилизованного агента- (например, при использовании непористых сорбентов — полистирольных плат или пробирок) или диффузионными затруднениями при использовании пористых сорбентов (сефароза, пористое стекло, силохром и т. д.); 3) методические сложности, связанные с трудностями точного дозирования и промывок иммуносорбентов на основе пористых носителей; 4) существенное влияние неоднородности сорбционных свойств полимерных носителей (микроплаты и пробирки из полистирола, поливинилхлорида, полиметилметакрилата и т. д.) на точность и воспроизводимость результатов анализа.
111
Большинство этих недостатков устраняется при переходе к гомогенным видам анализа, основанным на эффекте модуляции активности фермента при образовании комплекса антиген — антитело. Однако на сегодняшний день эти методы в совершенстве разработаны в основном для анализа низкомолекулярных антигенов. В связи с этим представляют интерес методы ИФА, позволяющие анализировать различные по молекулярной массе соединения без применения твердых носителей.
Одним из подходов является проведение стадии «узнавания» определяемого соединения специфическими антителами в растворе и дальнейшее разделение компонентов путем перевода образовавшегося специфического комплекса в нерастворимое состояние. По приведенной выше классификации такие методы относятся к гомогенно-гетерогенным. 'Разделение компонентов чаще всего достигается с помощью образующих преципитат антивидовых антител. Возможно использование в качестве осадителя полиэтиленгликоля и других соединений. Недостатком метода является длительность процесса разделения, в ряде случаев лимитирующего время всего анализа, и необходимость тщательного подбора условий осаждения.
