Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика имуноферментного анализа" -> 38

Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика имуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaimuntoferniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 32 33 34 35 36 37 < 38 > 39 40 41 42 43 44 .. 115 >> Следующая

102
путь является основным в ИФА. Однако в ряде случаев химическая модификация фермента невозможна без ухудшения его каталитических свойств, а антигена (антитела) —без снижения способности образовывать прочный иммунохимический комплекс. В связи с этим существенный интерес представляют методы ИФА, в которых ферментная метка вводится в процессе анализа нековалентно.
• Можно выделить следующие наиболее эффективные подходы:
1) использование комплекса фермент—антитело против фермента; отин.
3) введение ферментной метки через комплекс авидин — биотин.
Введение ферментной метки через комплекс со специфическими антителами против фермента наиболее часто применяется при использовании в качестве метки пероксидазы хрена. Этот анализ встречается в литературе под названием ПАП-метода (ПАП—пероксидаза—антипероксидаза).
В качестве примера приведем схему определения кроличьих антител против какого-либо антигена ПАП-методом. К иммобилизованному антигену добавляют исследуемую пробу. После инкубации и отмывки несвязавшихся компонентов к носителю добавляют анти-видовые антитела (например, сыворотку крови осла, иммунизированного IgG кролика). Проводят повторную инкубацию, отмывку и вводят в систему антитела кролика против пероксидазы. Смесь инкубируют, носитель отмывают и на последней стадии добавляют пероксидазу, образующую специфический комплекс с соответствующими антителами, который выявляют обычными методами. Одним из вариантов схемы является добавление на стадии 5) не антител против пероксидазы, а заранее приготовленного ПАП-комп-лекса. Схема метода:
2) отмывка
103
©
8) отмывка
Отметим, что ПАП-метод может быть формально отнесен к классифицированным ранее методам с использованием меченых антивидовых антител, только в данном случае используется не ковалентный конъюгат антивидовое антитело — фермент, а последовательно получаемый комплекс антивидовое антитело — антитело к пероксидазе — пероксидаза. Недостатком ПАП-метода‘ является удлинение схемы анализа, частичное ингибирование пероксидаз-ной активности при образовании комплекса с антителами, возможность диссоциации комплекса антитело—фермент при разведениях, промывках, изменениях pH и ионной силы среды.
Процедура анализа несколько упрощается по сравнению с ПАП-методом при использовании комплекса фермента с так называемыми гибридными антителами. Схема получения гибридных антител имеет вид
104
В результате ферментативного гидролиза получают (Fab') 2-фрагменты антител против определяемого антигена и используемого фермента. Смешивают продукты гидролиза и подвергают их воздействию восстанавливающего агента (например, меркапто-этанола), вследствие чего (РаЬ')2-фрагменты обратимо диссоциируют на симметричные части. После удаления восстанавливающего агента происходит рекомбинация Fab-фрагментов, в результате чего наряду с исходными образуются гибридные (РаЬ')2-фрагменты, один активный центр которых специфичен к детерминантам антигена, а второй — фермента.
При добавлении фермента образуется комплекс (Fab') 2-фермент, который может применяться для определения антигена в рассмотренных выше методах ИФА с использованием меченых специфических антител (например, в «сэндвич»-методе). При необходимости ферментная метка может вводиться после взаимодействия гибридного антитела с определяемым антигеном. Хотя этот подход был предложен около 20 лет назад и привлекает своей «элегантностью», он не нашел практического применения из-за трудоемкости получения реагентов.
Следующий метод нековалентного введения ферментной метки в гетерогенном ИФА антигенов и антигел основан на использовании авидина (основной гликопротеид, Мг=66000, компонент яичного белка) и биотина (витамин, Afr=228), образующих между собой комплекс, характеризующийся константой связывания 1015 М-1, что в десятки тысяч раз превышает характеристики связи антиген — антитело. Один из вариантов ИФА антител с использованием этой техники может быть проведен по схеме (см. с. 106).
Иммобилизованный антиген инкубируют с пробой, содержащей антитела, отмывают и добавляют антивидовые антитела, ковалентно связанные с биотином. Затем вносят авидин, образующий прочный комплекс с биотином, отмывают избыток белка и добавляют фермент с ковалентно пришитым биотином, который взаимодействует с другим центром связывания авидина. (Другим путем является использование антивидовых антител, ковалентно связанных с авилином, что упрощает анализ и сокращает его длительность.
• Достоинствами данного подхода являются универсальность конъюгата, используемого для анализа различных антигенов, и повышение чувствительности регистрации образуемого иммунохимиче-ского комплекса. Последнее обстоятельство обусловлено тем, что при синтезе конъюгата антитело—биотин с одной молекулой антитела может быть ковалентно связано до 90 молекул биотина. Молекула авидина имеет четыре центра связывания биотина, поэтому каждый специфический иммунохимический комплекс с участием определяемых антител на конечной стадии анализа будет содержать не одну молекулу фермента, а несколько десятков, что приводит к существенному выигрышу в чувствительности определения метки, а следовательно, и всего анализа.
Предыдущая << 1 .. 32 33 34 35 36 37 < 38 > 39 40 41 42 43 44 .. 115 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed