Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
100
Получение меченых антител для анализа методически более просто. Методы синтеза и очистки конъюгатов различных ферментов с иммуноглобулинами в настоящее время хорошо разработаны и унифицированы. С помощью имеющихся стандартных методик получают активные и стабильные препараты, что упрощает разработку методов иммуноферментного определения различных соединений. В ИФА могут быть использованы меченая глобулиновая фракция или IgG-фракция антител, аффинно выделенные антитела или их Fab-фрагменты. Целесообразность применения того или иного препарата следует оценивать применительно к конкретному случаю. Однако необходимо отметить, что применение меченой глобулиновой или IgG-фракции антител приводит к значительному (до 90%) непроизводительному расходу фермента-маркера, вследствие чего возрастает как стоимость анализа, так и вероятность усложнения интерпретации его результатов за счет увеличения вклада неспецифических взаимодействий.
Несмотря на универсальность методик введения ферментных меток в молекулы антител, многообразие антигенов затрудняет получение меченых специфических антител в количествах, обеспечивающих потребности массовых анализов. Кроме того, на ряд антигенов трудно получить высокоаффинные антитела, а дополнительная их модификация при связывании с ферментом может приводить к дальнейшему снижению способности взаимодействовать с антигеном.
В связи с этим применение в анализе меченых антивидовых антител упрощает процедуру получения реагентов для анализа, так как позволяет, используя одни и те же конъюгаты, осуществлять определение разных антигенов и антител различной специфичности. Кроме того, чувствительность анализа ряда антигенов в этом случае может быть выше, чем при применении меченых специфических антител, вследствие возможности связывания не одной, а нескольких меченых молекул. Однако такой подход методически усложняет проведение анализа из-за введения дополнительных стадий инкубации и промывки носителя.
Те же задачи, что и с применением меченых антивидовых антител, могут решаться при использовании конъюгатов фермента с белком А стафилококка, способного образовывать прочный комплекс с Fc-фрагментом иммуноглобулинов. Схемы ИФА при этом аналогичны рассмотренным выше для меченых антивидовых антител. Белок А (Л1г = 42 000) стабилен в растворимом и лиофилизо-ванном состоянии, что позволяет на его основе получать коммерческие «универсальные» конъюгаты с пероксидазой и щелочной фос-фатазой. Ограничение в применении меченого белка А связано с тем, что он с различной эффективностью взаимодействует с IgG разных млекопитающих и не реагирует с IgG птиц.
• При сравнении конкурентных и неконкурентных методов можно отметить следующее. Во-первых, как вытекает из теоретического
101
анализа, конкурентные методы обладают меньшей чувствительностью по сравнению с неконкурентными. Предел обнаружения различных соединений для них ограничен как чувствительностью регистрации ферментной метки, так и аффинностью антител, в то время как для неконкурентных методов, при отсутствии неспецифических взаимодействий, — только чувствительностью определения фермента. Поэтому для достижения высокой чувствительности анализа конкурентным методом необходимо использовать высокоаффинные антитела, что не всегда достижимо на практике.
Вторым общим недостатком конкурентных методов ИФА является возможность влияния различных эффекторов, содержащихся в анализируемых биологических жидкостях (сыворотка крови, сок растения, экстракты тканей и т. д.), на каталитические свойства ферментной метки. Во многих случаях подобный эффект может быть устранен путем многократного разведения исходного образца. Однако возможность его разведения зависит от содержания исследуемого соединения, что должно быть учтено при выборе схемы ИФА.
При выборе твердофазных схем определения следует учитывать, что скорость достижения равновесия в системе иммобилизованный реагент — анализируемое соединение зависит не только от концентрации компонентов, но может снижаться за счет микро-диффузионных эффектов. На анализ в таких системах, как правило, затрачивается время не менее нескольких часов. Переход к гомогенно-гетерогенным методам, в которых реакция образования первичного специфического иммунокомплекса протекает в растворе, значительно снижает время достижения равновесия на первой стадии. При этом сокращается и время анализа в целом, так как для разделения компонентов используется избыток иммобилизованных вторичных антител. Осуществление стадии «узнавания» в гомогенной фазе повышает также и точность анализа, которая определяется точностью дозирования компонентов. В тех случаях, когда анализируемая среда содержит эндогенный фермент, кофактор или эффектор, твердофазные неконкурентные методы являются наиболее эффективными.
§ 4. Методы гетерогенного ИФА, основанные на нековалентном способе введения ферментной метки
Рассмотренные выше методы гетерогенного иммуноанализа основаны на использовании ковалентных конъюгатов фермента с антителами или антигенами. В настоящее время этот
