Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Метод с использованием меченого антигена и иммобилизованных вторичных антител. Схема метода:
О + 0-0
^;о
1) инкубация
2) инкубация
0-0
О
о-©
о
97
и
и
9
ы
о
о—©
3) отмывка
4) определение ферментативной активности
Метод относится к гомогенно-гетерогенным, так как первая стадия взаимодействия антител с определяемым и меченым антигеном проходит в растворе. После установления в системе равновесия в раствор вносят носитель с иммобилизованными вторичными антителами, которые сорбируют образовавшиеся на первой стадии специфические иммунохимические комплексы. Часто отделение образовавшегося комплекса достигается за счет образования преципитата в присутствии растворимых антивидовых антител, необходимая для полноты осаждения концентрация которых предварительно должна быть точно подобрана. После проведения стадии отмывки несвязав-шихся компонентов определяют ферментативную активность на носителе или в преципитате. В литературе этот подход часто называют методом двойных антител (англ. double antibody assay).
Гетерогенные методы ИФА антител, основанные на определении оставшихся незанятыми мест специфического связывания (тип И). К этой группе относятся два метода (см. табл. 4.4), один из которых является неконкурентным, а второй конкурентным.
Неконкурентные методы
Метод с использованием меченых антител и иммобилизованного антигена. Схема метода:
1-0
-О
!' 1-0
>-
>-
1) инкубация
\-о>-
|-о>-
1-0
2) отмывка
1-0-
I-o
>-©
>ЧЕ)
>-©
3) инкубация
ОУ-
о>-©
>-©
4) отмывка
>-©
98
Схема по существу аналогична рассмотренному ранее методу последовательного насыщения для определения антигенов. К носителю с иммобилизованным антигеном добавляют анализируемый раствор. После установления равновесия в системе и частичного связывания анализируемых антител с носителем несвязавшиеся компоненты отмывают и добавляют меченные ферментом антитела той же специфичности. Таким образом, оставшиеся на носителе несвязанными с антителами антигены после первой стадии инкубации оттитровываются мечеными антителами.
Конкурентные методы
Метод с использованием, меченых антител и иммобилизованного антигена. Схема метода:
К иммобилизованному антигену добавляют анализируемый ггвор, содержащий фиксированное количество меченных ферментом антител. После установления в системе равновесия отмывают несвязавшиеся компоненты и определяют ферментативную активность на носителе. Необходимым условием проведения анализа является нахождение иммобилизованного антигена в недостатке по отношению к суммарному количеству свободных и меченых антител в растворе так же, как для всех конкурентных методов не исключается контакт ферментной метки с компонентами биологической жидкости, что накладывает дополнительные условия на выбор фермента.
2) отмывка
99
§ 3. Сравнительная оценка различных схем проведения гетерогенного ИФА
Как видно из предыдущего изложения, различные схемы проведения гетерогенного ИФА имеют как достоинства, так и недостатки. Несмотря на большое многообразие методов, в настоящее время невозможно выделить какой-либо из них, чтобы рекомендовать в качестве «универсального» для определения любых соединений. Выбор схемы анализа зависит от многих факторов, из которых основными являются молекулярная масса и валентность антигена, длительность анализа, состав среды, в которой необходимо определять антиген, свойства фермента, используемого в качестве маркера, и т. д.
Все рассмотренные методы гетерогенного ИФА основаны на использовании меченных ферментом антигенов или антител. При наличии меченого антигена проводят анализ с использованием малостадийных конкурентных схем. Если метка введена в высоко-очищенный антиген, то на конечной стадии можно измерить активность конъюгата, не связанного с иммобилизованными антителами, что позволяет исключить этап отмывки иммуносорбента и делает анализ удобным для автоматизации.
С другой стороны, анализ на основе меченых антигенов сопряжен с рядом сложностей. Разнообразие строения и физико-химических свойств антигенов препятствует созданию универсальных методов получения антигенферментных конъюгатов. Схема введения метки в один антиген часто оказывается неприемлемой при переходе к другому. По существу, синтез большинства конъюгатов антигенов с ферментами представляет собой самостоятельную задачу, сложность которой возрастает по мере уменьшения молекулярной массы и растворимости антигена.
Основной проблемой, стоящей особенно остро при введении ферментной метки в низкомолекулярные соединения, является доступность антигенных детерминант в образовавшемся конъюгате для взаимодействия с антителами. При использовании меченых гаптенов необходимо, чтобы связь маркера с ним осуществлялась через ту же функциональную группу, которая модифицировалась для синтеза конъюгата белок — гаптен для целей иммунизации и получения антител. Это накладывает дополнительные требования на выбор фермента-маркера. Кроме того, разделение конъюгата гаптен — фермент от несвязавшегося фермента, примесь которого может оказывать негативное влияние на результаты анализа, крайне затруднительно. Другим существенным условием получения меченых гаптенов является доступность очищенного антигена в значительном количестве, что осуществимо далеко не всегда.
