Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
88
исключает возможности образования тройного «сэндвич»-комп-лекса.
б. Метод с использованием меченых антивидовых антител и иммобилизованных специфических антител. Схема метода:
н °
^ !) инкубация
и+о
1=< о
2) отмывка
1Ь0
Но
И
>-
>-
>-
Ко>-
3) инкубация
4) отмывка
|=<о>— »-© !=<о>- ? »-© »-©
5) инкубация
|КО>— =^ОН7, + >-©-
=<
Метод является усложненным вариантом обычного двухцентрового или «сэндвич»-анализа, в котором образование комплекса детектируется не непосредственно введением в него меченного ферментом антитела, а с помощью содержащих ферментативную метку антивидовых антител. В качестве антивидовых (или вторичных) используют антитела, специфичные к глобулинам тех видов животных или птиц, которых иммунизировали антигеном для получения антисыворотки. Примером наиболее распространенных «антивидовых» конъюгатов являются меченные ферментом антитела кролика против иммуноглобулинов человека, меченые антитела козы (осла, барана и т. д.) против иммуноглобулинов кролика и т. д.
89
• Для того чтобы меченые антивидовые антитела не связывались с иммобилизованными на поверхности, необходимо использовать при образовании «сэндвич»-комплекса антитела, полученные от разных видов животных (на схеме такие антитела обозначены как
V— и у— • Несмотря на многостадийность и длительность проведения, достоинством метода является универсальность антивидового конъюгата, который может быть применен для анализа различных днтигенов.
Описанными методами ограничивается число возможных анализов антигенов по типу I. В табл. 4.1 для наглядности оставлены пустые графы, соответствующие конкурентным твердофазным методам, а также схемам с мечеными антигенами.
Гетерогенные методы ИФА антител, основанные на определении специфических иммунных комплексов (тип I). Так же, как в случае анализа антигенов, все методы определения антител, относящихся к данному разделу, являются неконкурентными (табл. 4.2).
Метод с использованием меченых вторичных антител и иммобилизованных антигенов. Схема метода:
~ОУ~
1-0
|о>
f-°
1-0
4) отмывка >-© *
|-о>-
|-°
-о
5) определение ферментативной активности
К иммобилизованному антигену добавляют исследуемую сыворотку и после инкубации и удаления несвязавшихся компонентов
90
выявление специфических иммунокомплексов проводят с помощью меченных ферментом антивидовых антител. Измеряемое на носителе содержание ферментной метки пропорционально концентрации специфических антител в сыворотке.
Данная схема является одной из наиболее распространенных -в ИФА антител, так как обладает всеми достоинствами «сэндвич»-метода, но отличается универсальностью меченого реагента, что дает возможность выявлять антитела к разным антигенам. Данный подход позволяет решать проблемы серодиагностики заболеваний человека и сельскохозяйственных животных, используя ограниченный набор антивидовых иммуноферментных конъюгатов, что значительно облегчает задачу производства реагентов для ИФА.
Метод с использованием меченого антигена и иммобилизованного антигена. Схема метода:
Исследуемую пробу инкубируют с иммобилизованным антигеном, после отмывки несвязавшихся компонентов для выявления образовавшегося специфического комплекса проводят инкубацию с меченным ферментом антигеном. Выявление образовавшихся на первой стадии иммунохимических комплексов происходит за счет взаимодействия свободных центров связывания с добавляемым в избытке меченным ферментом антигеном.
Метод с использованием меченого антигена и иммобилизованных антивидовых антител. Схема метода:
91
Смэ
4) отмывка
О-©
На первой стадии иммобилизованные антивидовые антитела связывают из раствора все антитела соответствующего вида. Наличие антител определенной специфичности в образовавшихся им-мунохимических комплексах выявляют титрованием антигенсвязы-вающих центров конъюгатом соответствующего антигена с ферментом. Метод основан на выявлении из множества связавшихся с иммуносорбентом антител молекул только одной специфичности, поэтому возможность его эффективного применения снижается при способности меченого антигена к неспецифическому связыванию с иммобилизованными на носителе белками или адсорбировавшимися на них после первой инкубации иммуноглобулинами.
Гетерогенные методы ИФА антигенов* основанные на определении оставшихся свободными центров специфического связывания (тип II). Схематично эта группа методов представлена в табл. 4.3. По сравнению с анализом типа I эти методы многочисленные и включают в себя как неконкурентные, так и конкурентные подходы, причем каждый из них в зависимости от использования на Первой стадии иммобилизованного реагента делится на твердофазный или гомогенно-гетерогенный. Рассмотрим каждый метод с учетом типа меченого и иммобилизованного реагента.
92
Неконкурентные методы
Метод с использованием меченых антител
и иммобилизованного антигена. Иммуноферментометрический метод. Метод является гомогенно-гетерогенным. Схема метода:
На первой стадии анализируемый образец смешивают с раствором, содержащим фиксированное количество меченных ферментом специфических антител. После инкубации и образования специфических иммунокомплексов в систему вводят избыток иммобилизованного антигена, который сорбирует оставшиеся несвязанными меченные антитела. После отмывки определяют ферментативную активность на носителе, которая обратно пропорциональна содержанию исследуемого антигена в образце. В литературе метод можно встретить под названием иммуноферментометрический.
