Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Таким образом, классификация методов ИФА может быть
Схема 4.2
82
пЬедставлена схемой 4.2, из которой следует большее многообразие анализов типа II и отсутствие конкурентных и гомогенно-гете-роренных методов типа I.
# На сегодняшний день разработано более тридцати вариантов различных методов ИФА, различающихся по характеру используемых реагентов и последовательности отдельных стадий. Такое множество вариантов анализа обусловлено в основном различными способами модуляции ферментативной активности в гомогенных методах и использованием различных комбинаций меченных ферментами и иммобилизованных на носителе реагентов (антигенов и антител) в гетерогенном ИФА.
Однако все эти методы могут быть классифицированы согласно приведенной выше системе. Более детальную классификацию известных методов гетерогенного и гомогенного анализов можно осуществить с учетом схемы 4.2 и типа используемых в анализе меченных ферментами реагентов — антигентов, антител и вторичных антител.
В связи с различиями в последовательности проведения отдельных стадий анализа целесообразно раздельно рассматривать методы определения антигенов и антител в гетерогенном и гомогенном ИФА.
§ 2. Классификация гетерогенных методов ИФА
Многообразие методов гетерогенного анализа, относящихся к типам I и II, обусловлено возможностью введения ферментной метки как в молекулу антигена, так и в молекулу антитела. Кроме того, для конкретной схемы анализа определяющим является, какой из реагентов—антитело или антиген, использован в иммобилизованном виде для разделения иммунохи-мических комплексов от несвязавшихся компонентов. Поэтому принцип разделения гетерогенных методов может быть представлен схемой 4.3.
Схема 4.3
83
В соответствии с таким делением в табл. 4.1 указаны варианты гетерогенных методов ИФА антигенов, основанные на определении специфических иммунных комплексов (т. е. относящихся к типу I), в табл. 4.2 —варианты гетерогенных методов ИФА антител типа I, в табл. 4.3 — гетерогенные методы ИФА антигенов, основанные на определении оставшихся свободными центров специфического свя-
Таблица 4.1. Гетерогенные методы ИФ\ антигенов,
основанные на определении специфических иммунных комплексов (тип I)
Меченый реагент Иммобилизованный реагент Неконкурентные Конкурентные
твердо- фазные гомоген* но-гете- рогеиные твердо- фазные гомоген- ио*гете- рогенные
Антитела Специфическое антитело ^МЕ) Антиген ^
Антитело ||—^ Есть
Антивидовое антитело ^ Есть
Антивидовое антитело Антигеи ^””(3
Антитело Ц—^ Есть
Антивидовое антитело |j—^
Антигеш —@ Антигеи Ц—
Антитело ^
Антивидовое антитело ^
зывания (т. е. относящихся к типу II), и в табл. 4.4 — гетерогенные методы ИФА антител типа II. Для наглядности таблицы имеют одинаковые графы, соответствующие максимальному количеству схем ИФА, хотя количество схем для данного типа анализа, естественно, меньше. Схемы, представленные в этих таблицах, достаточно полно отражают известные в настоящее время методы ИФА, но не затрагивают деталей, как, например, использование не целых антител, а только их Fab-фрагментов, типа носителя, способа получения иммуносорбента и т. д. Остановимся на более подробной характеристике каждого метода в порядке расположения в табл. 4.1—4.4.
Гетерогенные методы ИФА антигенов, основанные на определении специфических иммунных комплексов (тип I). К этой группе могут быть отнесены только три метода (см. табл. 4.1), причем все они являются неконкурентными.
Методы с использованием меченых антител и иммобилизованных антител. Один из наиболее распространенных на практике методов основан на применении меченных ферментом специфических антител и иммобилизованных антител. Схема метода:
84
и °
N*o -< о
Н°
? / -о. 2) отмывка
+ О-*
1ч
Но >-© -<о+ >-® -< >-©
4) отмывка
~КОУ~® 40
активности
Условные обозначения, используемые на этой и последующих схемах:
О , , »- — антиген, специфические и антивидовые антитела соответственно
О-®, >-© — компонент, в который введена ферментная метка
ю. К, И — иммобилизованный компонент
К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации на первой стадии на твердой фазе образуется специфический комплекс антиген—антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом антитела. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена. На стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченых антител, что послужило поводом для широкого распространения в литературе названия «сэндвич»-метод (англ. sandwich). Часто в литературе встречается и другое его название — двухцентровой метод ИФА (англ. two—site assay). Как следует из описания метода, он может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых существуют, по крайней
