Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
70
Определение каталитической активности пероксидазы с использованием. 5-аминосалициловой кислоты. Этот субстрат обычно применяется в случае визуальной детекции результатов ИФА, поскольку при его окислении образуются нерастворимые продукты, имеющие яркую коричневую окраску. К сожалению, в настоящее время в литературе отсутствуют данные по механизмам окисления этого субстрата, составу образующихся продуктов реакции, поэтому его использование для точных измерений в. области низких концентраций фермента может быть сопряжено с большими ошибками. о-Фенилендиамин позволяет регистрировать перокси-дазу спектрофотометрическим методом в диапазоне от 0,4 до 100 нг/мл, а 5-аминосалициловая кислота — от 5—10 до 800 нг/мл.
В 10 мл кипящей воды растворяют 8 мг 5-аминосалициловой кислоты. Раствор охлаждают до комнатной температуры, доводят pH до 6,0 с помощью 1 М NaOH и добавляют 1 мл раствора Н402 с концентрацией 10~4 М [концентрированный 30%-ный раствор (9,8 М) разводят приблизительно в 100 000 раз]. Затем добавляют в лунки микроплат по 0,2 мл субстратного раствора и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Измерение оптической плотности растворов проводят при 495 нм.
Определение активности пероксидазы с использованием диам-мониевой соли 2,2'-азино-ди-[3-этил-2,3-дигидробензотиазолин-6-сульфоновой кислоты] (АБТС). Метод основан на фотометрической регистрации катализируемой пероксидазой химической реакции:
+ Н2О2
NH* "03S
~^/S03-NH4+
+ 2Н20
В присутствии пероксидазы и Н2О2 при избытке АБТС при нейтральных’ значениях pH образуется стабильный катион-радикал, имеющий в растворе интенсивную зелено-голубую окраску (коэффициент молярного поглощения в максимуме спектра при длине волны 420 нм равен 43,2-103 М-’-см-1, при длине волны 405 нм — 18,6-103 М^'-см-1).
Готовят 0,02 М раствор АБТС (растворяют 1,1 г АБТС в 100 мл 0,067 М фосфатного буфера, pH 6,0, 0,144 г Na2HP04-2H20 +0,798 г КН2Р04 в 100 мл воды) и 0,01 М раствор Н202 (концентрацию перекиси водорода контролируют спектрофотометрически, используя коэффициент молярного поглощения при длине волны 230 нм е26о=72,4 М-1-см~!. Концентрированный 30%-ный раствор перекиси водорода (9,8 М) разводят приблизительно в 1000 раз. В реакционную кювету, содержащую 2 мл раствора образца, вносят 0,2 мл 0,02 М раствора
71
АБТС и 0,2 мл 0,01 М раствора Н202. Измеряют увеличение оптической плотности при длиие волны 405 или 430 нм,
Флуориметрический метод определения каталитической активности пероксидазы с использованием п-оксифенилпропионовой кислоты.
Растворяют 0,25 г очищенной я-оксифенилпропионовой кислоты в 50 мл 0,1 М фосфатного буфера, pH 8,0 (pH раствора смещается до 7,0). Приготовленный раствор субстрата добавляют в лунки микроплат (по 0,25 мл), содержащие на стенках специфически сорбированные конъюгаты пероксидазы, инкубируют 5 мин при 30°С и инициируют реакцию добавлением 0,05 мл 0,03%-ной Н202. Через 10—60 мин инкубации при 30 °С реакцию останавливают добавлением 0,2 мл 0,1 М глицин-NaOH буфера, pH 10,3. Измеряют интенсивность флуоресценции образцов (Я возбуждения 320 нм, испускания — 405 нм).
Хемилюминесцентные способы определения каталитической активности пероксидазы.
1. В полистирольную пробирку, содержащую специфические сорбированные на стенках конъюгаты Ат или Аг с пероксидазой, добавляют 10 мкл 3,6 мМ раствора ?)-люциферина в 0,0,1 М трис-HCl буфере, pH 8,0, и 1 мл смеси, содержащей 1,25 мМ люминола и 2,7 мМ перекиси водорода. Пробирку помещают в кювету люминометра и измеряют интенсивность хемилюминесценцип через 30 с.
2. В полистирольную пробирку, содержащую связанный со стенками конъюгат фермента, добавляют 20 мкл 10_3 М раствора люминола (1,8 мг люминола растворяют в 10 мл 0,1 NaOH) и 960 мкл 0,21 М NaOH, перемешивают, инкубируют 10—15 мии, после чего реакцию инициируют добавлением 20 мкл 5-10-2 М раствора Н202.
Глюкозооксидаза (КФ 1.1.3.4)
Структура. В качестве метки в иммуно-ферментном анализе обычно используют глюкозооксидазу из Aspergillus niger. Фермент представляет собой гликопротеин, содержащий 16% углеводных групп, молекулярная масса 160 000, в состав входят 2 молекулы связанного флавинадениндинуклео-тида. Коэффициент молярного поглощения фермента при длине волны 450 нм •—1,4Ы04 М-1-см-1. В нативном состоянии сульф-гидрильные группы в молекуле фермента не обнаруживаются, однако после денатурации в 8 М мочевине титруются 1—2 SH-группы на молекулу белка. Фермент обладает высокой стабильностью и сохраняет активность при хранении в течение нескольких лет в замороженном виде в концентрации 10 мг/мл.
Специфичность. Фермент катализирует реакцию окисления P-D-глюкозы кислородом с образованием перекиси водорода:
Р-Д-глюкоза + НгО + Ог-^-НгОг+Д-глюконо-б-лактон.
2-Д-арабиноза, 2-дезокси-/)-глюкоза и ионы Ag+, Hg2+, Cu2+ являются ингибиторами, pH-оптимум ферментативной активности равен 5,5.
Принцип измерения каталитической активности основан на регистрации продукта реакции — перекиси водорода с помощью пероксидазы хрена.
72
Фотометрический метод определения каталитической активности глюкозооксидазы с использованием о-фенилендиамина.
