Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Таким образом, даже такой простой расчет показывает возможность детекции ферментов в очень малых количествах. Причем принципиально осуществимым является значительное уменьшение пределов обнаружения ферментов как за счет увеличения времени ферментативной реакции, так и увеличения чувствительности регистрации образующегося продукта. В этой связи к перспективным относятся люминесцентные методы детекции ферментативных реакций, а также методы, основанные на ферментативном усилении детекции продуктов первичной ферментативной реакции («каскады»).
• К выбору ферментных меток в ИФА предъявляется ряд общих требований. Основными являются следующие:
а) высокая специфичность и удельная каталитическая активность фермента, позволяющая обнаруживать ферментативную метку в низких концентрациях;
б) доступность ферментов; возможность получения достаточно чистых ферментных препаратов, сохраняющих высокую ферментативную активность после химической модификации при получении конъюгата с антителами или антигенами;
в) стабильность в оптимальных условиях взаимодействия антигена с антителом;
(4.8)
[Р] = &кат[Е]0 Д^.
(4.9)
(4.10)
63
г) простота и чувствительность метода определения концентрации фермента.
В следующей главе будет дана подробная классификация методов ИФА. Здесь же следует отметить, что все методы ИФА можно отнести к двум различным категориям — гетерогенным и гомогенным. В гетерогенных методах используются иммобилизованные (т. е. прочно связанные) на поверхности твердых носителей реагенты, а в гомогенных — все стадии ИФА проводят в водном растворе. В гетерогенных методах фермент играет роль обычного маркера антигенов или антител, в то время как в гомогенных методах фермент выступает как составная часть иммунохи-мической реагентной системы и должен обладать рядом весьма специфических свойств. В табл. 3.1 и 3.2 приведены основные свойства ферментов, используемых соответственно в гетерогенных и гомогенных методах, и способы регистрации их активности.
Наибольшее распространение в гетерогенном ИФА среди ферментов, удовлетворяющих перечисленным выше требованиям, получили пероксидаза хрена (КФ 1.11.1.7), щелочная фосфатаза (КФ 3.1.3.1) и p-D-галактозидаза (КФ 3.2.1.23). Все три фермента определяются на уровне пикомолярных концентраций. Наиболее доступной является пероксидаза. Она содержит легко окисляемые перйодатом углеводные остатки, через которые может осуществляться связывание фермента, с антителами или антигенами. В состав субстратной системы для измерения активности пероксидазы фотометрическим способом входят хромогены, дающие при окислении перекисью окрашенные соединения. При работе с большинством из них следует учитывать их канцерогенные и мутагенные свойства и соблюдать осторожность. Каталитическая активность глюкозооксидазы регистрируется с теми же хромогенами, что и пероксидазы, однако чувствительность ее определения по сравнению с пероксидазой несколько ниже. Основным достоинством фермента является полное отсутствие его в плазме крови, что дает возможность использования фермента в гомогенных методах ИФА.
Щелочная фосфатаза и ее конъюгаты имеют высокую стабильность и низкий предел обнаружения, однако недостатком является относительно высокая стоимость фермента. В последнее время разработаны сверхчувствительные ферментативные системы, позволяющие детектировать в растворе до нескольких тысяч молекул щелочной фосфатазы, основанные на использовании в качестве субстрата молекулы NADP. Образующийся в результате ферментативного гидролиза продукт NAD определяется в ферментативной системе регенерации кофактора. Такого рода подходы для определения щелочной фосфатазы являются весьма перспективными в плане создания на их основе сверхчувствительных методов ИФА. fi-D-Галактозидаза является также широко используемым ферментом как в гомогенном, так и в гетерогенном ИФА.
G4
Таблица 3.1. Ферменты, используемые в гетерогенном ИФА
S Н S Я
ZS о
а а
f- 4> ОЛ S^7
« 5
»я
•я 2
я я
»я я ъз о а> сг » о а> ЕГ Я О. н я о я о а)
я о. н н О) S я S
О) я 2
S о. ч
о о я
н >» s
о ч О)
е е X
•Я
Я
ъз
ч
О)
•я
я
•я
й « s S
ЕГ От
s Й о. ?
Е- -Л
О) я S Си
° 2 н >> о ч •01 6*
»я
я
Ъ2
Я
Он
н
О)
S
о
н
о
е
•я
я
о
ч о « о. ? н
Z а) ч
<Т)
я Я • R К Sf &g CQ
о s ?=* •9* ч ~
" о U я Н
gua
о
я
о
я
я
о
о.
я
•9-
tt
я то ' о < t-ю то
2 ^ ж
о -S “
Q. * О '©*
ц-< Я я я ЛзЗи,
ТО —
5- «О
Н ТО I
я И С <и о ч ч
я
S
2
ч
J'SJ-
оО^
Одо
я >_?
Ъ2 —
о
-е*
5 *
5 о.
*9* а
о-е*
о к •9*4
ч ч я о я о
0J ?
*9“ >. о ч Си Я н н я QJ
Е <
4 4 5
Q
СО.
Eg
CN го
о
S
о
о.
><
о
X
о
в « * н
я °
о
Я 5
я “
ч «
О то х я
2»к
н m ч я я о н \о й О Я Q,
< н я я
о
CS
к
к
я
К
<
К
S
a § a со 2 <м со Чс
"VO
о
о
X ч ^ (N S
я я О S
н я
S ч X ш
я со
то
' SS X Н >, ас s
г-
I
ю
т
со
со
I
«А
к а -в и
л я (- s *s н Яг?
<и id cl са s >>
о
о
о
о
о
СО
о
о
Tf
о
о
о
о
о
<N
и*
IS"
о о о о о о
о о о о о
о о о о о о
о о о CD о о
о оо со LO
