Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Как всякий аналитический метод ИФА имеет свои ограничения, связанные, прежде всего, с «шумом», который становится все более значимым по мере того, как растет чувствительность детектирующих систем. Этот «шум» обусловлен биологической природой молекулы детектора (антитела), усилителя (фермента). Изучение природы этих «шумов» и способов их подавления составляет один-из необходимых этапов разработки высокочувствительных методов ИФА.
В данной книге рассмотрен широкий круг теоретических и практических вопросов, связанных со свойствами антител и ферментов, способов получения реагентов, оптимизации условий проведения анализа, необходимых как разработчикам методов ИФА, так и тем, кто использует готовые реагенты. Она рассчитана на очень широкий круг исследователей, которые могут избирательно относиться к отбору необходимого для них материала, выполняя роль и учебного и справочного пособия.
Авторы выражают благодарность за участие в написании отдельных глав книги сотрудникам кафедры химической энзимологии МГУ им. М. В. Ломоносова Н. В. Сорокиной (гл. 5) и С. А. Еремину (гл. 7) и Института биохимии им. А. Н. Баха. АН СССР Т. В. Чередниковой (гл. 6) и Д. Н. Юрьеву (гл. 9, 10).
Авторы
Введение
Иммунохимические методы анализа, основанные на специфическом связывании определяемого соединения соответствующими антителами, широко вошли в аналитическую практику и используются в различных областях медицины, сельского хозяйства, микробиологической и пищевой промышленности, для целей охраны окружающей среды. Иммунохимическая реакция в растворе между антителами и антигенами (в гл. 1 будет введено точное определение термина «антиген», однако здесь мы будем понимать под ним идентифицируемое вещество, против которого выработаны соответствующие антитела) протекает в не* сколько стадий, первой из которых является обратимое образование комплекса состава 1:1. Вследствие наличия в молекуле антител более одного центра связывания для поливалентных антигенов возможно дальнейшее многостадийное образование сложных комплексов с различным соотношением в нем компонентов.
Классические методы иммунохимического анализа основаны на образовании антителами в присутствии антигена преципитата (осадка), однако для визуальной регистрации процесса преципитации необходимы высокие концентрации компонентов и длительное время проведения реакции. Результаты такого анализа не всегда можно однозначно интерпретировать и, кроме того, в большинстве случаев они носят качественный или полуколичественный характер. Кроме того, для многих одновалентных антигенов (гап-тенов), например гормонов, лекарственных соединений, эти методы непригодны.
Индикация образовавшегося комплекса антиген — антитело в растворе может быть осуществлена, если в один из исходных компонентов реакционной системы ввести метку, которая легко детектируется соответствующим высокочувствительным физико-химическим методом. Весьма удобными для этой цели оказались изотопные, ферментные, флуоресцентные, парамагнитные метки, использование которых дало возможность увеличить чувствительность иммунохимических методов в миллионы раз, а время анализа уменьшить до нескольких часов.
Для достижения высокой специфичности, чувствительности, воспроизводимости, экспрессности и автоматизации иммунохимических анализов принципиально возможным является использование только первой стадии простого иммунохимического взаимодействия. Так как процесс комплексообразования пары анализируемое соединение (антиген) — специфическое антитело происходит в строго количественном соотношении, то экспериментально устанавливаемая концентрация метки, входящей в состав образующегося
5
иммунохимического комплекса, однозначно связана с исходной концентрацией антигена.
Для осуществления такого анализа необходимо провести эффективное разделение комплексов от свободных компонентов. Эту задачу оказалось легко решить, если один из компонентов пары антиген — антитело прочно иммобилизовать (связать) на твердом носителе. Иммобилизация позволяет предотвратить агрегацию в растворе и осуществить физическое разделение образующихся иммунных комплексов от свободных компонентов. Возможность прочного связывания на носителе антител или антигенов с сохранением их способности к специфическому образованию иммунных комплексов и разработка на этом принципе твердофазных методов дали мощный импульс для развития новых подходов в иммуно-химических методах анализа.
Новые иммунохимические методы, основанные на применении меченых реагентов, нашли широкое распространение для количественного определения биологически активных соединений самой разнообразной структуры — от низкомолекулярных гормонов до высокомолекулярных вирусов и целых клеток.
Наибольшее развитие среди них получил радиоиммунологиче-ский анализ (РИА), предложенный в конце 50-х годов. Благодаря возможности определять метку, которой являлся изотоп 1251, в очень малых концентрациях, удалось достигнуть высокой чувствительности анализа (на уровне пкг/мл). Разработка РИА явилась поворотным моментом в развитии иммунохимических методов анализа, положившим начало целой серии методов с использованием различных меченых соединений. За разработку метода его авторы Р. Йалоу и С. Берсон в 1977 г. были удостоены Нобелевской премии.
