Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
(3.23)
46
В координатах Ig-[А.Г-Ат]/_[Ат]о--s-Ig[Ar], называемых коор-
I — [Аг.Ат]/[Ат]0
дннатами Хилла, должна получаться прямая с тангенсом угла наклона, равным единице, пересекающая ось ординат в точке Igtf (рис. 12).
Взаимодействие одной субпопуляции антител с поливалентным антигеном. Рассматриваемый ниже случай может реализоваться, например, при связывании Fab-фрагментов моноклональных антител с клетками, вирусными частицами и т. д., имеющими на своей поверхности большое число одинаковых центров связывания. Выражение для константы равновесия взаимодействия антитела, имеющего по п эпитопов, записывается следующим образом:
[Аг-Ат]
-К. (3.24)
(п [Аг]0 — [Аг-Ат]) [Ат]
Уравнение Скэтчарда в этом случае принимает вид
? 1А;;А1т3 ^Кп [Аг]0 — к [Аг • Ат]. (3.25)
[Ат]
Варьируя концентрацию антител в системе при постоянной концентрации [Аг]о, можно определить константу комплексообразо-вания К и число мест связывания в антигене п.
Так как молекулы антител обладают, по крайней мере, двумя центрами связывания, то при взаимодействии с поливалентным антигеном возможно образование так называемых комплексных связей, когда после взаимодействия одного активного центра молекулы антитела с одним из эпитопов второй активный центр взаимодействует с расположенным поблизости вторым эпитопом той же молекулы антигена. Общая эффективность взаимодействия в этом случае существенно возрастает; в частности, эффективная константа комплексообразования для молекулы lgG может в 103 раз и более превышать Ко одиночных связей. Частота образования таких связей зависит от концентрации реагентов и может колебаться от нуля до максимальной, соответствующей общему количеству молекул igG в системе.
Взаимодействие двух субпопуляций антител с моновалентным антигеном. Одним из простых приближений при описании реальных систем взаимодействия моновалентного антигена (гаптена) с антителами может быть модель, согласно которой набор популяций антител заменяется двумя — высокоаффинной и низкоаффинной, каждая из которых характеризуется собственной константой комплексообразования — /Ci и Кг. Задача определения констант и концентраций каждой из фракций антител перед экспериментаторами возникает часто. Знание численных значений этих Параметров весьма важно для разработки конкретных наборов для иммуноферментного анализа и выбора схемы проведения имму-
47
ноанализа с целью достижения требуемой чувствительности определения антигена и специфичности анализа.
В условиях равновесия рассматриваемая схема взаимодействия
Дг-j-AT^ Ar-ATj
Агт|-Ат2^: Аг-Ат2 (3.26)
описывается системой следующих алгебраических уравнений:
is [Аг• Ат;] ш тг _ [Аг-Ат2] . /о пп\
[ArHAtJ ’ 2 [Аг] [Ата! ’
1Аг10=[ Аг] + [ Аг • Atj] + [ Аг • Ат2];
1Атг]0=[Ат1] + [Аг-Ат1]; [Ат2]0=[Ат2]+[Аг-Ат2]. (3.28)
Опуская алгебраические преобразования (читатель может найти детальное описание аналогичной системы, например, в книге Варфоломеева С. Д. Зайцева С. В.), дадим окончательное выражение зависимости, описывающей связь параметров системы в координатах Скэтчарда:
[^(IAt^o—^)+/Г2([Ат210—,0)4-
ЦАт,]0 - ?)4-К2([Ат2]0-5)12 4-4^5 ([Ат,]0 4-[Ат2]0 - В)\,
(3.29).
где fi = Si-f-52 = [Ar-ATi]+[Ar-Ат2]; 77=[Аг]. Графическая зависимость B/F от В имеет вид гиперболы (рис. 13). Таким образом, получаемая при анализе зависимости связывания неизвестной популяции антител с антигеном в координатах Скэтчарда вогнутая кривая может свидетельствовать о существовании двух фракций антител — высокоаффинной и низкоаффинной. (Следует указать, что аналогичные зависимости могут наблюдаться и в более сложных случаях существования трех и более популяций антител, а также при отрицательной кооперативности связывания поливалентного антитела с лигандом.)
Для определения четырех неизвестных параметров — Ki, Ка, [Ati]0 и [Атг]о можно воспользоваться одним из следующих методов.
1. Параметры можно оценить по углам наклона асимптот гиперболы и отрезкам, отсекаемым ими на оси абсцисс и ординат (рис. 13). Для построения асимптот используют следующий прием. По концевым участкам экспериментальной кривой проводят прямые, которые дают первоначальное приближение констант К\ и Къ (tgass/C'i; tg Путем параллельного перемещения
прямых подбирают такое их положение, чтобы сумма отрезков, отсекаемых ими на осях координат1, была равна соответствующим
48
(3.30)
отрезкам на тех же осях, отсекаемых самой кривой при экстраполяции ее к осям координат:
OC=ON+OP;
OA=OM-\-OQ.
Отрезки на оси абсцисс ОМ и оси ординат ON дают оценочные значения для [Ati]0 и [Ат2]0 соответственно. Подставляя оценочные значения Ки К.2, [Ati]o и [Ат2]0 в выражения для Bi и В2 [Ат1]0 [Аг] Ki .
Вх
В.г
1 + Кх [Аг] [Ат2]ь [Аг] Къ 1 + К.2 [Аг]
(3.31)
(3.32)
Рнс. 13. Определение констант связывания двух субпопуляцнй антител с моновалентным антигеном
Рис. 14. Графический способ нахождения асимптот для расчета констант связывания двух субпопуляцнй антител с моновалентным антигеном
находят приближенные параметры Вi и fi2 и В=В1+В2 при различных концентрациях Аг.
