Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика имуноферментного анализа" -> 17

Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика имуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaimuntoferniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 11 12 13 14 15 16 < 17 > 18 19 20 21 22 23 .. 115 >> Следующая

43
антител и строгие требования к структуре изучаемых антигенов. Вследствие этого флуоресцентные методы не являются универсальными и могут быть применены для ограниченной группы антигенов.
Методы тушения биолюминесценции основаны на использовании в качестве маркера АТР, пришитой к.' молекуле антигена. В составе такого комплекса молекула АТР сохраняет активность в реакции биолюминесценции, катализируемой светлячковой люциферазой. При добавлении антител образуется комплекс с антигеном, в котором молекула АТР становится недоступной ферменту, в результате чего ингибируется реакция биолюминесценции. Указанный метод обладает высокой чувствительностью, что позволяет измерять константы ассоциации до 10-12 М.
Перечень экспериментальных методов определения аффинности взаимодействия антиген — антитело приведен в табл. 2.1.
§ 4. Способы расчета констант комплексообразования реакции антиген — антитело
Взаимодействие одной субпопуляции антител с моновалентным антигеном. Этот наиболее простой случай реализуется, например, при связывании гаптена с Fab-фрагментами моноклональных антител и описывается простейшей схемой (3.1).
Из системы уравнений материального баланса
1Ат]0=[АтЖАг.Ат1 ,
[Аг]0=[Аг] + [Аг - Ат] V ‘ '
с учетом (3.3) для константы равновесия комплексообразования можно легко получить выражения равновесной концентрации образовавшегося комплекса
[Аг-Ат]=- ^-С-т]о[А-г]- . (3.17)
1 J 1 + К [Аг] v '
1. Один из часто используемых способов расчета константы состоит в исследовании зависимости образующегося комплекса от общей концентрации антигена [Аг]о. Если при достаточно больших концентрациях антигена в системе выполняется условие [Аг]о»[Ат]о, то (3.17) принимает вид
[Аг-Ат]=АВ1ЫА?1о__ (318)
1 J I + К [Аг 10 v '
Эта зависимость (рис. 9) является аналогом изотермы адсорбции Лэнгмюра в теории адсорбции или уравнения Михаэлиса—Мен-тен в ферментативной кинетике. Из выражения (3.18) следует,
44
что при предельных значениях концентрации [Аг]о концентрация Комплекса [Аг-Ат] стремится к общей концентрации центров связывания [Ат]0. Для вычисления К определяют концентрацию антигена [ArJ'o, при которой половина антител находится в виде комплекса с антигеном ({Аг-Ат]=[Ат]0/2). С учетом выражений
(3.16) и (3.17) можно получить
[Аг]о=—- . (3.19)
К &
Из выражения (3.19) следует, что [Аг]'о = 1//С при условии 1//О[Ат]0 (т. е. либо антитела являются низкоаффинными; либо их концентрация мала). При обратном соотношении (1//С'С[Ат]о) данный метод определения К неприемлем.
Рнс. 9. Зависимость концентрации Рис. 10. Графическое определение кон-образующегося комплекса [Аг-Ат] от станты связывания в двойных обрат-общей концентрации антигена в ра- ных координатах створе [Аг]0
2. Иногда для вычисления константы связывания К используют представление экспериментальных данных зависимости (3.19) концентрации комплекса от концентрации свободного антигена в системе двойных обратных координат:
~-=-!--!--1---!— . (3.20)
[Аг-Ат] К [Ат]0 [Аг] [Ат]0 4 '
При постоянной концентрации антител в системе варьируют начальную концентрацию антигена и в условиях равновесия определяют концентрацию свободного и связанного в комплекс антигена. График в двойных обратных координатах представляет собой
прямую линию с тангенсом угла наклона ---, отсекающую
К [Ат]0
на оси ординат отрезок 1/[Ат]0 (рис. 10). В условиях избытка антигена ([Аг]»[Ат]0) анализ проводят в координатах 1/[АгХ ХАт]ч-1/[Аг]0.
45
3. Наиболее часто для анализа комплексообразования используют метод Скэтчарда, основанный на исследовании зависимости отношения равновесной концентрации комплекса [Аг-Ат] к концентрации свободного антигена [Аг] от концентрации комплекса.
Аналитический вид уравнения Скэтчарда легко получить из выражения для константы комплексообразования (3.3) и уравнения материального баланса (3.16):
[Аг-Ат]
[Аг]
=ЛГ[Ат]0 — АГ [Аг-Ат].
(3-21)
Рис. 11. Графическое определение константы связывания в координатах Скэтчарда
Рис. 12. Графическое опредеелние констаиты связывания в координатах Хилла
В литературе часто эти координаты обозначают в символах B/F-^-B (В — от английского слова bound — связанный, F — free — свободный). Зависимость Скэтчарда имеет вид прямой с тангенсом угла наклона — К, отсекающей на оси ординат отрезок К [Ат]о, а на оси абсцисс [Ат]0 (рис. 11). Графическая обработка экспериментальных данных в координатах Скэтчарда позволяет вычислить не только равновесную константу связывания, но и концентрацию активных центров антител [Ат]0 в системе.
На практике при нахождении константы данным способом проводят серию опытов по определению равновесной концентрации свободного антигена (или комплекса) при различных начальных концентрациях антигена и постоянной концентрации антител в системе.
4. В качестве еще одного преобразования уравнений (3.3) и
(3.16) используют следующее:
=У|АГ[- (3'22) Разделив числитель и знаменатель части равенства на концентрацию антител [Ат]о и логарифмируя выражение, получаем [Аг.Ат]/[Ат]0
1 - [Аг'Ат]/[Ат]0
= lgtf+lg[Ar].
Предыдущая << 1 .. 11 12 13 14 15 16 < 17 > 18 19 20 21 22 23 .. 115 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed