Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика имуноферментного анализа" -> 111

Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика имуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaimuntoferniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 105 106 107 108 109 110 < 111 > 112 113 114 .. 115 >> Следующая

279
Методика проведения анализа
1. В лунки полистирольного планшета вносят раствор IgG-фракции антител в ФБ с концентрацией 5 мкг/мл. Инкубируют 3 ч при 37°С, затем отмывают лунки ТФБ. Адсорбированные антитела могут храниться до использования при 4°С в течение 6 мес.
2. В первые ряды лунок вносят по 0,2 мл стандартных растворов, содержащих инсулин, в различных концентрациях, а в остальные анализируемые образцы -^разведенные в два раза ТФБ. Каждую точку дублируют трижды.
3. Инкубируют прн 4°С в течение 12—16 ч, затем тщательно отмывают лунки ТФБ и вносят в них по 0,2 мл раствора конъюгата Инс-ПХ и ТФБ.
4. Инкубируют 15 мин при 37°С (или 1 ч при 4°С), промывают лунки ТФБ и вносят субстратную смесь (см. § 1 этой главы).
5. При проведении спектрофотометрйческой детекции реакцию проводят в течение 20 мнн, затем останавливают добавлением 50 мкл 4 М H2S04 и регистрируют оптическую плотность продукта пероксидазного окисления о-фенилеи-диамииа при А,= 492 нм.
При хемилюминесцентиой детекции активности ПХ в лунки планшета вносят по 0,2 мл субстратной смеси на основе люминола и л-йодфенола. Планшет помещают в кювету люминометра и регистрируют интенсивность светового излучения в условных единицах.
Интерпретация результатов
1. На основании результатов измерения стандартных растворов строят калибровочный график и определяют по нему концентрацию инсулина в исследуемых образцах.
§ 7. Определение тироксина
Определение тироксина (Т4) необходимо при проведении эндокринологических обследований для оценки функции щитовидной железы, а также для контроля эффективности • терапии ряда заболеваний.
В данном разделе рассмотрен конкурентный метод определения тироксина, основанный на одновременном связывании определяемого (Т4) и меченного пероксидазой Т4 (Т4-ПХ), адсорбированными на полистироле специфическими антителами.
Реагенты, материалы и оборудование,
необходимые для проведения анализа
Антитела к тироксину; конъюгат Т4-ПХ; реагенты для спектрометрической (с о-фенилендиамином) или хемилюминесцентиой детекции ПХ; стандартные сыворотки, содержащие Т4 в известной концентрации (от 0 до 400 нм/л); полистирольные планшеты (прозрачные для спектрофотометрического и непрозрачные для хемилюмннесцентного способа определения ПХ; микропипетки; спектрофотометр или люминометр.
Получение антител
В анализе используют 7-глобулииовую фракцию антисыворотки кролика к конъюгату Т4 с бычьим сывороточным альбумином (БСА), выделенную по стандартной методике,
280
Получение конъюгата Т4-ПХ
К раствору N-трифторацильного производного тироксина (40 мг) в 250 мкл диметилформамида добавляют 6 мг N-оксисукцини-мида и 10 мг дициклогексилкарбодиимида в 250 мкл диметилформамида. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре 1 ч и добавляют порциями по 100 мкл к раствору 20 мг* пероксидазы (RZ = 3,1) в 1 мл 0,1 М карбонатного буфера и 0,5 мл диметилформамида. Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при 4°С и затем очищают путем хроматографирования на колонке с сефадексом G-50 в фосфатном буфере.
Методика проведения анализа
1. В лунки полистирольного планшета вносят раствор Y-глобулнновой фракции антисыворотки в ФБ с концентрацией белка
5 мкг/мл. Инкубируют 12—16 ч при 4°С, затем удаляют раствор и трижды промывают лунки ТФБ.
2. В первые ряды планшета вносят по 20 мкл стандартных сывороток, содержащих известное количество Т4 и 200 мкл раствора конъюгата Т4-ПХ с концентрацией 50 нг/мл по ПХ. Конъюгат разводят в веронал — мединаловом буфере (см. § 1 этой главы), содержащем 0,2 г БСА и 0,2 г анилиионафталин-сульфокислоты. Инкубируют 2 ч при комнатной температуре, затем тщательно отмывают лунки ТФБ.
3. В лунки, в зависимости от выбранного способа детекции ПХ, добавляют по 0,2 мл субстратной смеси для фотометрического или хемилюминесцентиого определения и проводят измерение аналогично описанному в § 6, п. 5 раздела Методика проведения анализа.
Интерпретация результатов
По данным измерения стандартных растворов строят калибровочный график, по которому определяют концентрацию тироксина в исследуемых образцах,
§ 8. Определение тестостерона
Определение содержания стероидного гормона тестостерона (ТС) в сыворотке крови необходимо для диагностики ряда эндокринных заболеваний. Данные об уровне тестостерона в крови и ее следах также могут использоваться в судебно-медицинских исследованиях для идентификации половой принадлежности.
В данном разделе рассмотрен конкурентный метод ИФА, включающий конкуренцию адсорбированного на полистироле и определяемого тестостерона за центры связывания специфических антител, с последующим выявлением специфического комплекса на твердой фазе меченными пероксидазой антивидовыми антителами (А. В. Захарычев и др., 1987).
Реагенты, материалы и оборудование,
необходимые для проведения анализа
Антитела против тестостерона; конъюгат тестостерона с соевым ингибитором трипсина (ТС-СИТ); меченные пероксидазой антиви-довые антитела; стандартные растворы с известной концентрацией ТС; реагенты для приготовления субстратной смеси на основе о-фенилендиамииа; полисти-рольные планшеты для ИФА; автоматические пипетки; спектрофотометр.
Предыдущая << 1 .. 105 106 107 108 109 110 < 111 > 112 113 114 .. 115 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed