Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
§ 5. Определение вирусов картофеля
Своевременное выявление вирусов в посевном материале и выбраковка зараженных растений являются одним из способов борьбы с заболеваниями картофеля, приводящими к значительному снижению урожайности этой культуры.
В основе этого раздела лежат данные по разработке ИФА пирусов картофеля (А. Ф. Бобкова и др., 1983; Н. М. Нацвлншвили и др., 1985), обобщенные в методических рекомендациях (И. Г. Атабеков и др., 1985), утвержденных отделением защиты растений ВАСХНИЛ.
Идентификация вирусов проводится «сэндвич»-методом ИФА, включающим последовательное взаимодействие вируса с адсорбированными на полистироле антителами, а затем с конъюгатом антител с пероксидазой. Измеряемая активность фермента на твердой фазе пропорциональна начальной концентрации вируса и служит характеристикой его содержания в исследуемом образце.
Реагенты, материалы и оборудование, необходимые для проведения анализа
Вирусы картофеля (X, Y, М, S); специфические антитела против вирусов; конъюгат специфических антител с пероксидазой; положительный и отрицательный стандарты; субстратная смесь для определения пероксидазной активности на основе 5-АС (см. § 1 данной главы); полисти-рольные планшеты; автоматические пипеткн; спектрофотометр.
Получение высокоочищенных вирусных препаратов
1. X, Y, М, S вирусы картофеля (ХВК, YBK, МВК и SBK соответственно) выделяют нз специально зараженных растений. Схема выделения включает гомогенизацию листьев, осветление экстракта центрифуги-
276
рованием и встряхиванием с четыреххлористым углеродом. К осветленному Экстракту добавляют ПЭГ-115, отделяют полученный осадок центрифугированием и трижды экстрагируют 0,005 М боратиым буфером, pH 7,5. Дальнейшая очистка вирусов проводится ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Полученный осадок дважды экстрагируют буфером и концентрируют вирус дифференциальным центрифугированием при 80—100 тыс. g.
Выделяемые таким образом препараты вирусов не содержат пигментов растения-хозяина и характеризуются типичным для нуклеопротеидов спектром поглощения в ультрафиолетовом свете (максимум при ^,=260—265 нм, минимум при ^,=247 нм). Соотношение Е2бо/Е28о составляет для ХВК 1,2; УВК—1,15— 1,20; МВК и SBK—1,2—1,25. Коэффициент седиментации в зависимости от вируса и растворителя находится в пределах 115—200 S. Очищенный препарат не должен реагировать с антисывороткой, приготовленной к экстракту из здоровых растений; в электронном микроскопе должны обнаруживаться в препаратах только нитевидные вирионы.
Препараты вирусов хранятся в течение длительного времени при —20°С в присутствии 50%-ного глицерина.
Получение антисывороток к вирусам
картофеля
1. Первая инъекция: 1 мг антигена вводится кролику внутривенно.
2. Вторая инъекция (через 4 недели): 1 мг антигена в смеси с полным адъювантом Фрейнда вводится подкожно в несколько точек на спине животного.
3. Третья инъекция (через 2 недели): 1 мг вируса в смеси с адъювантом Фрейнда вводят подкожно в несколько точек на спине животного или в мышцы обеих задних ног.
4. Кровь собирают в период между 2-й и 4-й неделями, считая от последней инъекции. Через 4 недели проводят реиммунизацию. Для этого 1 мг вируса в смеси с полным адъювантом Фрейнда вводят подкожно в несколько точек или внутримышечно в две точки.
Титры сывороток, полученных пб предлагаемой схеме, достигают в среднем 2,5 -10-2—5 -10—2 в методе капельной преципитации и 10-5—10_6 в методе ИФА.
Для работы используют моноспецифнческие антисыворотки-, в которых отсутствуют антитела к компонентам клетки здорового растения. Нарушение этого условия приводит к значительному увеличению ложно положительных результатов при проведении анализа.
Выделение иммуноглобулинов
Иммуноглобулины выделяют из антисывороток по
следующей схеме:
1. 2 мл антисыворотки разводят 1: 1 дистиллированной водой п добавляют равный объем 20%-ного водного раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) с Мг= = 6000.
2. Центрифугируют при 8000 об/мин в течение 15 мин, осадок растворяют в 4 мл ФБ.
3. К 4 мл растворенного осадка добавляют 4 мл 20%-ного водного раствора ПЭГ и центрифугируют вторично при 8000 об/мин в течение 15 мин.
4. Осадок растворяют в 1 мл ФБ и диализуют против этого же буфера в течение ночи.
5. Концентрацию иммуноглобулинов определяют спектрофотометрически по формуле Агво'Х.фактор разведения • 0,77 = С[мг/мл], где Л28о — оптическая плотность раствора при Х=280 нм; С — концентрация иммуноглобулинов в растворе,
277
6. Хранят иммуноглобулины лнбо в 50%-ном глицерине, либо при —20°С в растворе с конечной концентрацией белка 1 мг/мл. Перед связыванием с пероксидазой иммуноглобулины прогревают при 56°С в течение 30 мнн для увеличения стабильности конъюгата при хранении.
Получение конъюгата иммуноглобулинов
с пероксидазой (Ат-ПХ)
1. Синтез конъюгата Ат-ПХ осуществляют перйодат-ным методом по методике, описанной в гл. 7, § 2. Выделение, характеристику и хранение конъюгата осуществляют как описано ранее.
Методика проведения анализа
1. Адсорбция антител: адсорбционную иммобилизацию антител проводят из раствора с концентрацией 5 мкг/мл в ФБ. В лунки планшета вносят по 0,2 мл раствора. Затем планшеты закрывают крышками и инкубируют в течение ночи при +4°С. На следующий день содержимое лунок сливают' н планшеты промывают ТФБ 3—4 раза, тщательно встряхивая после последней промывки. Связанные антитела после высушивания планшетов на воздухе могут храниться прн —20°С в течение нескольких месяцев без потери способности взаимодействовать с вирусом.
