Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
2. Если для целей исследования достаточным является знание относительного содержания вируса, то в качестве положительного и отрицательного стандарта используется материал от заведомо больного и достоверно здорового животного.
3. При определении антител в качестве положительного и отрицательного стандартов используется пул сывороток крови и молозива от больных и здоровых животных,
274
Методика проведения ИФА для выявления
ротавирусного антигена
1. В луяки полистирольных планшетов вносят по
0,2 мл раствора специфических иммуноглобулинов в ФБ в концентрации 5 мкг/мл и инкубируют в течение 18 ч при 4°С или 2 ч при 37ЯС. Затем удаляют раствор белка и 3—4 раза отмывают лунки ТФБ.
2. В лунки с иммобилизованными иммуноглобулинами вносят по 0,2 мл специфического (положительного), контрольного (отрицательного) и исследуемых антигенов в разведении 1 : 50. Одновременно проводят титрование положительного н отрицательного антигенов. Пробы разводят ТФБ. Тщательно перемешивают в течение 5—7 с н инкубируют в термостате 1,5—2,0 ч при 37°С. Затем трижды отмывают лунки от несвязавшихся антигенов ТФБ. При качественной постановке реакции (ответ «есть» или «нет») постановку осуществляют аналогично, но материал не титруют, а ставят не менее трех повторных опытов с разведением 1 : 50.
3. В отмытые лунки вносят по 0,2 мл раствора конъюгата Ат-ПХ в ТФБ с концентрацией 2000 нг фермента в I мл, инкубируют 1,5 ч при 37°С н отмывают лунки ТФБ. Затем добавляют 0,2 мл субстратной смеси на основе 5-АС.
4. Через 40 мин реакцию останавливают внесением в каждую лунку по одной капле 5N. HCJ. Оптическая плотность образующегося продукта реакции пропорциональна содержанию антигена в исследуемых пробах.
Методика проведения ИФА для выявления
антиротавирусных антител
1. В лунки планшетов вносят по 0,2 мл раствора специфического антигена (см. с. 273) в ФБ с концентрацией 10 мкг/мл и инкубируют в течение 18 ч при 4°С. Затем удаляют раствор антигена и 4— 5 раз- отмывают лунки ТФБ.
2. В лункн с адсорбированным антигеном вносят по 0,2 мл стандартных—? положительной и отрицательной и испытываемых сывороток в разведении 1 :30. Для количественного определения антител в сыворотках их тнтруют последовательным двукратным разведением в ТФБ, начиная с разведения 1 :30. Тщательно перемешивают в течение 5—7 с и инкубируют в термостате 1,5—2 ч при 37°С. Затем 4—5 раз лункн отмывают от несвязавшихся антител ТФБ. При качественной постановке реакции (ответ «есть» или «нет») постановку осуществляют аналогично, но сыворотки не титруют, а ставят не менее трех повторных опытов с разведением 1 : 30.
3. В отмытые лунки вносят по 0,2 мл раствора конъюгата (Ati-ПХ) в ТФБ в концентрации 2000 нг фермент? в 1 мл, инкубируют 1,5—2,0 ч при 37°С и отмывают лунки тем же раствором. Затем добавляют 0,2 мл субстратной смеси на основе 5-АС.
4. Через 30 мин реакцию останавливают внесением в каждую лунку пй одной капле 5N HCI и измеряют оптическую плотность.
Интерпретация результатов
Инструментальная регистрация результатов анализа проводится спектрофотометрически при А,=450 нм.
При отсутствии необходимости строгого количественного определения содержания вируса или антител учет результатов ИФА может проводиться визуально, по цветовой шкале зависимости интенсивности окраски продукта перокси-дазной реакции от содержания исследуемого соединения.
1. При определении концентрации антигена значение оптической плотности, полученное при анализе исследуемой пробы, сравнивается с калибровочными графиками титрования положительного и отрицательного стандартов, Концен-
275
трация вируса в исследуемом материале определяется умножением значения, полученного по калибровочному графику, на разведение пробы при анализе.
Для большей достоверности результатов исследуемый материал рекомендуется анализировать в нескольких разведениях, а искомую концентрацию вируса определять как среднее.
2. При качественном определении вируса (ответ «есть» или «нет») его наличие считается доказанным, еслн регистрируемая оптическая плотность продукта ферментативной реакции в случае испытуемой пробы более чем з 2 раза пре-вышает среднее значение оптической плотности отрицательного стандарта.
3. Исследуемая на содержание специфических антител сыворотка считается сероположительной, если среднее значение регистрируемой оптической плотности продукта пероксидазной реакции превышает соответствующее значение для отрицательного стандарта (Л) не менее чем в 3 раза среднеквадратичную ошибку определения А (см. гл. 10, § 3).
4. При визуальной оценке результатов реакции интенсивность окраски продукта пероксидазной реакции, измеренная при анализе исследуемого материала, сравнивается с интенсивностью окраски, полученной для положительного и отрицательного стандарта в тех же разведениях. Качественную оценку наличия вируса или антител в образце удобно проводить по цветной шкале:
Н—|—|—|--интенсивное коричневое окрашивание;
++-1--коричневое окрашивание;
+-1--светло-коричневое окрашивание;
--окрашивание отсутствует или находится на уровне отрицательного контроля.
