Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
I Далее проводят анализ как описано выше.
i Если оптическая плотность пробы с нейтрализующей сывороткой в два раза В более ниже, чем с нормальной, то наличие HBsAg в данном образце считается доказанным.
При постановке реакции нейтрализации ставится три положительных и семь отрицательных контролей (те же, что и в обычной реакции). Оптическая плотность стандартных положительных проб после инкубации с конъюгатом, содержащим нейтрализующую сыворотку, должна быть в два раза и более ниже, чем с нормальной сывороткой, и приближаться к уровню отрицательных контролей. Оптическая плотность отрицательных стандартных проб с нейтрализующей и нормальной сывороткой не должна статистически различаться. В противном случае нейтрализация считается неспецифической, а результаты — недостоверными,
§ 4. Определение ротавируса и специфических антител
Заболевания молодняка крупного рогатого скота (к.р.с.), вызываемые ротавирусом, наносят значительный ущерб животноводству. Одной из мер борьбы является диагностика заболевания на ранних стадиях, для чего необходимы высокочувствительные методы детекции вируса.
В основу этого раздела положены результаты работы по созданию ИФА ротавируса, обобщенные в методических рекомендациях (Г. Ф. Коромыслов и др., 1984), утвержденных отделением ветеринарии ВАСХНИЛ.
Реагенты, материалы и оборудование,
необходимые для проведения анализа
Ротавирусный антиген, специфические антитела против ротавируса (АТ), конъюгат специфических антител с пероксидазой (Ат-ПХ), антивидовые антитела против иммуноглобулинов быка, меченные пероксидазой (Ati-ПХ), положительные и отрицательные стандарты для выявления ротавируса и специфических антител, компоненты для приготовления субстратов на основе 5-АС (см. § 1 этой главы), полнстирольные планшеты, микропнпетки, спектрофотометр.
Получение ротавирусного антигена
1. Ротавирусный специфический антиген — вируссодержащая суспензия, полученная путем размножения ротавируса в культуре клеток МА-104, концентрированная полиэтиленгликолем (Afr=6000) и отцен-трифугированная при 6000g. Антиген проверен на специфичность с эталонной антиротавирусной сывороткой в РДП. Антиген лиофилизован в ампулах по 1 мл. Срок годности 1 г. (может быть продлен после проверки в реакции ИФА). В качестве контроля используют нативную или лиофилизованную суспензию неинфицированных клеток МА-104.
Получение антител
1. Сыворотка специфическая антиротавирусная получена гнпериммунизацией кроликов вирусом, очищенным в градиенте плотности хлорида рубидия, Лиофилизована в ампулах по 1 мл, Срок годности сухой сыворотки 3 г.
273
2. Иммуноглобулины выделены из гипериммунной антиротавирусной сыворотки высаливанием насыщенным раствором сульфата аммония с последующей ионообменной хроматографией на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Лиофилнзова-ны в ампулах по 1 мл. Срок годности лиофилизованного препарата 1 год (может быть продлен после проверки в ИФА). В качестве контроля используют иммуноглобулины, выделенные по аналогичной методике из сыворотки крови, не содержащей антител к ротавирусу.
3. Антисыворотку кролика против иммуноглобулинов быка получают гипер-нммунизацией по стандартной методике. IgG-фракцию антисыворотки выделяют как описано в п. 2.
Получение конъюгатов антител с пероксидазой
1. Синтез конъюгатов Ат-ПХ и АтгПХ осуществляли перйодатным методом согласно методике, описанной в гл. 7. Выделение, характеристику и хранение конъюгатов проводили аналогично описанным ранее методикам.
Испытуемый материал и его отбор
1. Определение ротавируса проводят в материале от больных и павших телят (фекалии, тонкий отдел кишечника). Пробы фекалий отбирают в стерильные флаконы. Для исследования используют жидкую часть фекалий нли супернатант 20—30%-ной суспензии фекалий илн кишечника. Прн приготовлении суспензии кусочек кишечника измельчают и растирают в ступке до образования однородной массы. Суспензию промораживают в течение 18— 20 ч при —10°С, осветляют центрифугированием при 3000 g в течение 20 мин и надосадочную жидкость используют для исследования в ИФА.
2. Сыворотки получают от животных в количестве 5—6 мл, хранят в замороженном состоянии. Допускается их консервирование мертиолатом (1 : 1000) или добавлением антибиотиков. Сыворотку молозива или молока получают по общепринятой методике путем обработки их сычужным ферментом.
Положительные и отрицательные контроЛи (стандарты) для выявления ротавирусного антигена и антител
1. Количественное определение вируса илн антител в исследуемом материале проводят при использовании калибровочных зависимостей оптической плотности продукта пероксидазной реакции от содержания вируса или антител в положительных и отрицательных стандартных пробах. При необходимости определения концентрации вирусных частиц в исследуемой пробе положительный стандарт получают путем внесения известного количества очищенного вируса в материал (фекалин, фрагменты тонкого отдела кишечника) от здоровых животных, не содержащий ротавируса. Этот же материал используется в качестве отрицательного стандарта.
