Фотосинтез С3 и С4 растений механизмы и регуляция - Эдвардс Дж.
Скачать (прямая ссылка):
Источники данных: ,[34, 35, 45, 48, 49, 63].
8.4. Хроматографический анализ
Изучение ВПФ-цикла было основано на хроматографическом анализе водорослей, которые получали 14СОг (разд. 6.7). Бассэм и его сотрудники из Беркли в Калифорнии (прежде всего Марта Керк, которой также принадлежат большие заслуги в более ранних исследованиях) применили этот подход к изолированным хлоропластам (рис. 8.7), Как и в случае многих других методов, используемых для изучения изолированных хлоропластов, главный недостаток этого подхода (помимо его трудоемкости) состоит в том, что он не позволяет четко отличать процессы внутри хлоропластов от тех явлений, которые происходят во внешней среде при повреждении оболочки этих пластид.
Источники данных: [16, 17].
8.5, Фильтрация центрифугированием
Этот метод был впервые предложен Веркхайзером и Бартли, а затем Клингенберг и его сотрудники стали широко применять его для изучения митохондрий. Хельдт весьма успешно использовал этот метод в своих опытах с хлоропластами (разд. ¦8.23). Сущность метода сводится к следующему: хлоропласты, содержащие радиоактивный метаболит, пропускают под действием центрифужной силы через фильтрующий слой силиконового масла, под которым находится слой денатурирующего агента, например хлорной кислоты. Затем отрезают дно центрифужной пробирки с осадком хлоропластов и хлорной кислотой и определяют распределение метки между ними (рис. 8,9). „Добавление различных немеченых метаболитов позволяет также изучать степень обратного обмена (например, между мече-
Аспартат
Триозофосфаты
¦mm*-
4V
Монофосфаты
JP Фосфоглицериновая'
КИСП0Та I
; Дифосфаты
^ ' "'Я "Vvf:V V-
Старт
А
I
Н
¦ S-
о.
о
/«1 CL j
Растворитель II
Рис. 8.7. Двумерная радноавтограмма продуктов кратковременной фиксации 14С02 изолированными хлороплс.стами гороха. После освещения реакционную смесь подкисляют для того, чтобы остановить реакцию и освободить “СОг из бикарбоната. Исследуемый образец наносят на бумагу и проводят хроматографию в смеси феиол — вода. Затем бумагу вынимают из камеры, сушат, поворачивают на 90° и хроматографируют во втором направления в смеси бутаиол — уксусная кислота. В результате каждое соединенна занимает на хроматограмме определенное место. Соединения идентифицируют при помощи параллельной хроматографии с известными стандартами. Положение каждого соединения определяют после получения радиоавтографа путем наложения на хроматограмму рентгеновской пленки в темной комнате. Там, где присутствуют радиоактивные соединения, на плепке после проявления будут видны темные пятна. Радиоактивность подсчитывают либо непосредственно' на хроматограмме при помощи счетчика Гейгера, либо более точно в сцин-тилляциоином счетчике после элюирования соединений из пятен. Метод двумерной хроматографии на бумаге был впервые разработан Мартином и Синджем. Впоследствии Кальвин, Бенсон и Бассэм и их соавторы применили этот метод с использованием |‘1С-соединений для изучения ВПФ-цикла (гл. 6).
ным неорганическим фосфатом в хлоропластах и триозофосфа-' том на переносчике фосфатов). В тех случаях, когда меченое соединение способно подвергаться метаболизму (например, при добавлении к хлоропластам меченого неорганического фосфата на свету при комнатной температуре), распределение продуктов можно изучать при ;помощи колоночной хроматографии. Поскольку небольшое количество среды остается связанным с хлоропластами даже после фильтрации через силиконовое масло, следует ставить параллельные опыты с мечеными соединениями, например декстранами, которые не проходят через мембраны (разд, 8.22).
Источники данных: |[6, 32, 37, 66].
8.6. Косвенные методы изучения транспорта метаболитов
Эти методы основаны на том, что можно воздействовать на ‘поведение или функциональную активность хлоропластов, добавляя во внешнюю среду различные реагенты. Например, если какое-либо соединение стимулирует или подавляет фотосин^ тез, это достаточно убедительно говорит о том, что оно способно проникать через мембрану хлоропластов. Данное утверждение относится прежде всего к тем соединениям, которые могут влиять на процессы, протекающие в строме или тилакоидах хлоропластов (рис. 8.10). Недостатки подобного подхода проистекают из того, что полученные результаты не могут быть однозначно истолкованы. Ведь некоторые из добавленных соединений способны воздействовать на фотосинтез и не проникая внутрь хлоропластов, а другие могут сначала подвергаться изменениям во внешней среде и только после этого проникают через мембрану хлоропластов.
Источник данных: i[41],
8.7. Сокращение индукционного периода
