Фотосинтез С3 и С4 растений механизмы и регуляция - Эдвардс Дж.
Скачать (прямая ссылка):
Рис. 8.4. Схематическое изображение хлоропласта по Хельдту и факсимиле заголовка первой статьи Молиша о получении фотографий па листьях растений. Сейчас нас особенно интересует достигнутая здесь степень разрешения, так как главным метаболитом, который выносится из хлоропластов, служит триозофосфат, а основным метаболитом, поступающим в результате транспорта в проводящие ткани, является сахароза. Если инкубировать диски листьев в растворе сахарозы в темноте, то крахмал образуется равномерно до всей ткани, т. е. для синтеза крахмала свет не требуется, он нужен только для фотосинтеза. Возникает вопрос, почему образующаяся при фотосинтезе сахароза, которая в опытах по получению изображений на крахмале должна на своем пути к проводящим тканлм проходить через непосредственно прилегающие затемненные клетки, не размывает изображения. Сама сахароза не может повторно проникать в хлоропласта, но если экзогенная сахароза способна инициировать синтез крахмала в темноте, то туда должны проникать продукты ее деградации. Не исключено, что все это просто вопрос концентрации. Возможно также, что сахароза, образующаяся при фотосинтезе, и экзогенная сахароза поступают в разные отделы клетки. В чем бы ия заключалась причина этого явления, она должна быть связана с транспортом метаболитов. Очевидно, что транспорт метаболита будет наиболее эффективным, если этот метаболит оказывается каким-то образом защищенным от деградации па пути к проводящим тканям. Как именно достигается эта защита в листьях, мы узнаем лишь тогда, когда поймем, почему изображения на крахмале отличаются столь замечательной четкостью.
' и bet «Re H«r*telW«g vrm PtHrtofraphten ш etneift Lsisbbiatte'i
Outer Membrane
\'
).
#
'Ф m # Щ
«Й ft # f ft #
* * & 49 # # * 1r
# ¦# # # > y>
t » # fr «
# # # # ¦ #
•V # ¦ # Г* \
„ # * # # t #
#¦##€' «/# % % * * # # •• > » <
* * * * • # # #1
I.% щ sStefc A A A? ilk Ль A s
Рис. 8.6. А Увеличенный фрагмент предыдущей фотографии. Видно, что крахмал образуется только в освещенных участках листа. Б. При максимальном увеличении хорошо видны замыкающие клетки устьиц (показаны стрелками) между точками, нарисованными на исходной схеме, так как они не утрачивают крахмал в темноте и остаются в виде крошечных пар черных пятнышек или «скобок», беспорядочно разбросанных на фотографии. Они служат шкалой длиной в одну замыкающую клетку, по которой можно оценивать дискретную природу образования крахмала.
Быстрое фракционирование в водных растворителях применяется реже, но и оно проливает свет на прижизненную локализацию тех метаболитов, которые не сразу выделяются из разрушенных органелл.
Источники данных: [10, 11, 42, 50, 51, 62, 64].
8.3. Экспериментальная основа исследований транспорта in vitro
Мы рассмотрели сейчас фракционирование целых тканей, но возможен и другой подход к изучению транспорта метаболитов. Он заключается в выделении функционально активных органелл и выяснении того, что они образуют in vitro и что выделяют в окружающую среду. Выделение функционально активных хлоропластов — далеко не простая задача (приложение А). Прошло почти тридцать лет, прежде чем Роберту Хиллу удалось продемонстрировать С02-зависимое выделение кис-
150 мкл
г
суспензии протопластов
Нейлоновая сетка (диаметр отверстий 20 мкм)
50 мкл 0,4 М сорГЗнтола
100 мкл силиконового масла
-50 мкл 0,4 М сахарозы-
Рис. 8.6. Новый метод, разработанный Робинсоном для быстрого отделения цитоплазмы и хлоропластов от изолированных протопластов. Суспензию протопластов помещают в верхний контейнер, где их можно освещать или подвергать иной обработке. В нулевой момент времени их разрушают центрифугированием через сетку с диаметром отверстий 20 мкм. Цитоплазма остается над слоем силиконового масла, а хлоропласты проходят через него в денатурирующий раствор. Данный метод позволяет быстро определять распределение метаболитов между этими двумя фракциями при фотосинтезе или дыхании.
лорода изолированными хлоропластами, скорость которого была сравнима с выделением 02 в присутствии искусственных акцепторов водорода. Кроме того, хлоропласты — очень хрупкие •органеллы, и, поскольку вероятность присутствия хлоропластов с разрушенными оболочками и дальнейшего их разрушения при выделении достаточно велика, проведение эксперимента и интерпретация его результатов неизбежно усложняются. Предложенный нами в последние годы способ получения изолированных протопластов (приложение А) и разработанный Робинсоном метод быстрого отделения хлоропластов от остальных клеточных фракций значительно повысили ценность исследований in vitro (рис. 8.6). В двух нижеследующих разделах мы рассмотрим прямые методы, применяемые в таких исследованиях.
