Фотосинтез С3 и С4 растений механизмы и регуляция - Эдвардс Дж.
Скачать (прямая ссылка):
каким-то образом контролироваться. Данные, накопившиеся за последнее десятилетие, свидетельствуют о том, что основными соединениями, которые поступают внутрь хлоропласта, являются неорганический фосфат и С02, а экспортируются в основном триозофосфаты (рис. 8.2). В следующих разделах мы рассмотрим, как изучали транспорт этих, а также некоторых других соединений. (Методы, при помощи которых были получены эти данные, приведены также в табл. 8.1.)
8.2. Экспериментальная основа
исследований транспорта — фракционирование целых тканей
Для изучения путей метаболизма широко используется радиоактивный углерод. Казалось бы, самый простой способ исследовать транспорт — это вводить ИС02 в интактный лист, затем гомогенизировать его и определять, какой продукт фотосинтеза выделяется из хлоропласта. Однако осуществить это в эксперименте довольно трудно в силу нескольких причин. Во-первых, транспортируемый метаболит должен в конечном счете подвергаться дальнейшему метаболизму, а такие процессы, как ВПФ-цикл и гликолиз, используют одни и те же промежу-
Таблица 8.1, Методы изучения транспорта метаболитов в хлоропластах
A. Информация о распределении и транспорте метаболитов in vivo
I. Фракционирование клеток в неводной среде
а) Кинетические измерения концентрации и распределения субстратов
б) Кинетические измерения распределения метки
II. Фракционирование клеток в водной среде
Определение содержания метаболитов в интактных хлоропластах после «быстрого» выделения
Б. Информация о распределении и транспорте метаболитов in vitro
I. Прямые методы изучения хлоропластов, выделенных в водной среде
а) Изучение распределения метаболитов или метки между хлоропластами и средой
б) Определение концентрации субстратов после центрифугирований хлоропластов через слой силиконового масла
II. Косвенные методы изучения хлоропластов, выделенных в водной среде
а) Изучение влияния добавленных метаболитов на метаболизм хлоропластов
б) Определение активности «защищенных» ферментов
в) Изучение осмотической реакции хлоропластов на внесение метаболитов
B. Изучение распределения метаболитов или метки между хлоропластом и клеточной средой с использованием изолированных протопластов
точные продукты. Поэтому, естественно, не так-то просто установить, переносится ли соединение X из хлоропласта в цитоплазму в неизменном виде или — для облегчения транспорта — оно сначала превращается в Y, а затем снова в X на первой стадии последующего метаболизма. Во-вторых, хлоропласты и другие субклеточные органеллы, как правило, очень малы и весьма хрупки. Представьте себе, что вы пропустили через мясорубку сумку с покупками; если вы не знали, какие именно покупки были сделаны, и не можете прочитать, что написано на пакетах, вряд ли вы сумеете точно установить содержимое каждого пакета. Многие методы фракционирования клеток являются столь же грубыми. Если же позволить листьям осуществлять фотосинтез в присутствии 14С02, затем быстро заморозить их в жидком азоте, а потом уже проводить фракционирование в неводных растворителях, тогда у нас будут основания считать, что соединения, находившиеся внутри хлоропластов во время фотосинтеза, останутся там и при фракционировании. Правда, при использовании данного метода некоторое количество крахмала обнаруживается не только во фракции хлоропластов, т. е. этот метод тоже несовершенен. Тем не менее он позволяет получить ценную информацию о распределении метаболитов. ([{Следует отметить, что крахмал относится к тем немногим соединениям, локализацию которых можно лег-
Рис. 8.3. Крахмал, Зимой 1864 г. знаменитый немецкий физиолог растений Закс подверг повторному освещению частично закрытый фольгой лист без крахмала и показал при помощи реакции крахмала с иодом, что крахмал вновь образовался только в освещенных хлоропластах. [В подобного рода опытах крахмал из листьев удаляется после инкубации их в темноте в течение 24—28 ч. Затем их освещают и кипятят в 80%-ном этаноле, где экстрагируется хлорофилл, а обесцвеченную ткань листа отмывают водой и окрашивают раствором иода в иодистом калии. Комплекс крахмала с иодом на самом деле имеет синий цвет (амилаза окрашивается в синий цвет, а амило-пектии — в фиолетовый), но при большой концентрации выглядит черным.] В двадцатых годах этого века Молпш повторил опыты Закса, но он освещал лист через фотографический негатив и получил па нем позитивное изображение. Этим методом можно добиться очень красивых картинок из крахмала. Здесь вы видите репродукцию картины «Невинность», которую Поль-Пьер Прудон (1758—1823 гг.) в свое время нарисовал мелом. В данном случае она выполнена крахмалом на листе Pelargonium и, пожалуй, нисколько не проиграла от этого.
ко установить невооруженным глазом (рис, 8.3—8.5). Если экстрагировать хлорофилл из листа горячим этанолом и окрасить обесцвеченную ткань иодом, то крахмал благодаря реакции амилозы с иодом четко выступит в виде сине-черных гранул. В интактном листе эти гранулы связаны с пластидами.]
