Фотосинтез С3 и С4 растений механизмы и регуляция - Эдвардс Дж.
Скачать (прямая ссылка):
Степень интактности, которую дает феррицианидная проба, не всегда является показателем способности хлоропластов к •фотосинтетической ассимиляции С02 и по ряду других причин.
Время, мин
Рис, А.1. Определение степени интактности хлоропластов с использованием феррицнаиида в качестве окислителя в реакции Хилла. Хлоропласты были выделены из протопластов пшеницы. 1 — экстракт протопластов после осмотического шока, II—иитактные протопласты, III — хлоропласты после осмотического шока, IV — интактпые хлоропласты. Расчетная степень интактности для протопластов равна 94%, для хлоропластов — 95%. Числа в скобках — количество выделившегося 02 в мкмоль-(мгХл)-1-ч-1 с учетом поправки на поглощение 02 кислородным электродом.
Так, например, хлоропласты подсолнечника, полученные после механического разрушения ткани листа, имеют очень высокую степень интактности, но скорость фиксации СОг у них очень мала. Вполне возможно, что у таких хлоропластов нарушены какие-то другие свойства, например, неправильно функционирует система переносчиков в оболочке хлоропласта (гл. 8), которую можно в некоторых случаях повредить в процессе выделения хлоропластов, В группе так называемых хлоропластов типа А могут существовать различные подгруппы. (Аналогичный метод был использован Доусом и др. для определения степени интактности изолированных митохондрий. Для этого измеряли активность сукцинат-цитохром-с — окшдоредуктазы до и после осмотического шока, о которой судили по восстановлению экзогенного цитохрома с. В случае интактных митохондрий цито-хром с не проникает через наружную мембрану. Для того что-
бы цитохром восстановился, нужно, чтобы он каким-то образом получил доступ ,к внутренней мембране митохондрий.)
Когда хлоропласты выделяют из протопластов, для определения степени интактности можно воспользоваться и другим способом. Экстракт протопластов центрифугируют при низкой скорости, чтобы отделить хлоропласты от тех ферментов, которые находятся вне этих органелл. Определяют активность такого фермента, который, как считают, целиком и полностью локализован в хлоропластах in vivo, например NADP-глицераль-дегидфосфатдегидрогеиазы в экстракте, полученном из осадка хлоропластов (ХП), и в надосадочной жидкости (НЖ):
ХП
Степень интактности(%) = 100-
Точность этого метода определяется тем, насколько полно выявляется активность исследуемого фермента во фракции хлоро-пластов и в надосадочной жидкости. Некоторые ферменты типа РуБФ-карбоксилазы при попадании в бесклеточный экстракт становятся лабильными или ингибируются. Поэтому очень важно, чтобы активность фермента в суммарном бесклеточиом экстракте (полученном без применения осмотически активных веществ) была равна сумме активностей этого фермента во фракции хлоропластов и в надосадочной жидкости.
Среды, применяемые для исследования фотосинтетичес-кого метаболизма в изолированных хлоропластах, сильно различаются по составу. Наиболее важные условия определения активности Сз- (гл. 8) и С^хлоропластов (гл. 12) были рассмотрены иам« в предыдущих главах.
А.8. Очистка
Независимо от того, как были выделены хлоропласты, т. е. после механического разрушения ткани или из протопластов, их следует отделить центрифугированием. Иногда этого бывает вполне достаточно для получения интактных хлоропластов. Таким образом можно почти полностью избавиться от тех фракций, которые загрязняют препарат хлоропластов (цитоплазма, пероксисомы и митохондрии), поскольку они почти полностью остаются в надосадочной жидкости, а интактные хлоропласты седиментнруют после центрифугирования в течение 1—2 мин (при 300—2000g в зависимости от состава среды). Большая часть разрушенных хлоропластов тоже остается в надосадочной жидкости, а в осадке после центрифугирования, в самых оптимальных условиях содержится от 70 до 100% интактных хлоропластов.
При необходимости можно удалить и тилакоиды. Для этого следует отцентрифугировать препарат в среде, не содержа-
щей никаких солей (0,33 М сорбитол, доведенный трисом до pH 7,5); это помогает удержать поврежденные хлоропласты в надосадочиой жидкости. Но чтобы избежать значительной потери активности при хранении, полученный в конце концов препарат интактных хлоропластов все-таки следует хранить в среде, содержащей соли.
Для очистки хлоропластов и других органелл применяют центрифугирование в градиенте концентрации сахарозы. Однако при такой обработке хлоропласты подвергаются воздействию слишком высоких концентраций осмотически активного вещества, что может привести к снижению фотосинтетической активности. Для того чтобы создать высокую плотность при сравнительно низкой осмотической концентрации вещества в градиенте, можно воспользоваться высокомолекулярными полимерами. Так, например, очищенные и функционально активные хлоропласты гороха и шпината можно получить после очистки в лерколле (коллоидном растворе частиц кремниевого золя, покрытых поливинилпирролндоиом). Неочищенный препарат хлоропластов можно наслоить на 40%-ный (по объему) перколл, •содержащий 0,33 М сорбитол и какой-нибудь буфер. После центрифугирования при 2500 g в течение 1 мин материал, не входящий в хлоропласты, будет находиться в надосадочиой жидкости, а в осадке соберутся интактные хлоропласты. Можно провести центрифугирование и в линейном градиенте пер-колла (приблизительно от 10 до 90%). Неочищенный препарат хлоропластов наслаивают на такой градиент и затем центрифугируют в течение 15 мин приблизительно при 10 000 g. Интактные хлоропласты, сконцентрировавшиеся на участке градиента, отвечающем их плавучей плотности, можно будет собрать, раскапав градиент по фракциям, и затем промыть их для удаления перколла. Одним из самых последних достижений в области выделения органелл является метод отделения хлоропластов от балластного материала в течение нескольких секунд после лизиса протопластов (разд. 8.3). Этот прием особенно удобен для изучения компартмеитации метаболитов и продуктов фотосинтеза в клетке во время ассимиляции углерода.
