Фотосинтез С3 и С4 растений механизмы и регуляция - Эдвардс Дж.
Скачать (прямая ссылка):
Протопласты, которые всплывают хуже, можно очистить в водной двухфазной системе, приготовленной после смешивания двух полимеров: декстрана и полиэтиленгликоля. Такая смесь состоит из.5,.5%-ного (вес/объем) полиэтиленгликоля6000, 10%-ного (вес/объем) декстрана Тго, 10 мМ натрий-фосфатного буфера (.pH 7,5) и 0,46 мМ сорбитола. Если тщательно смешать 0,6 мл препарата неочищенных протопластов и 5,4 мл двухфазной смеси и затем отцентрифугировать в течение 5 мин при 300 g и 4°С, протопласты перейдут на границу раздела фаз, а хлоропласты соберутся в нижней фазе. Отобранные из промежуточной фазы протопласты можно снова ресуспеидировать и затем промыть .соответствующей средой.
Хранение
Протопласты мезофилла наиболее устойчивы, когда их хранят при сравнительно низких pH и в присутствии некоторых двухвалентных катионов (например, в 0,4 М сорбитоле, содержащем 1 мМ CaCla и 20 мМ MES, pH 6,0). Результаты исследований, проведенных на пшенице, ячмене и табаке, говорят о том, что сорбитол вполне подходит для того, чтобы поддерживать осмотические свойства среды по меньшей мере в течение 8—10 ч при условии, что протопласты хранят во льду. Если препарат держат при 25 °С, то и протопласты, и выделенные из них хлоропласты теряют фотосинтетическую активность, что указывает иа непригодность сорбитола в этом случае. В то же время протопласты не теряют своих фотосинтетичееких свойств и при 25 °С по меньшей мере в течение 10—20 ч, если осмотически активным веществом среды является сахароза.
Выделение хлоропластов из протопластов
[. Средний диаметр протопластов мезофилла у Сз- и С^-рас-тений составляет примерно 30—40 мкм, а для протопластов САМ-растений . эта величина равна по меньшей мере 60— LOO мкм. Для выделения хлоропластов можно использовать быстрый и эффективный прием, который заключается в том, что суспензию протопластов несколько раз пропускают через нейлоновое сито (с отверстиями размером 20 мкм, если работают с Сз- и- Сграстениями, или размером 44 мкм, если работают с САМ-растениями). Для этого можно натянуть нейлоновую сетку на пластмассовый шприц одноразового применения (•объем шприца 1 мл), у которого кончик отрезан так, что размер отверстия приблизительно равен 3 мм. Часть протопластов можно разрушить, если-суспензию два-три -раза пропустить через шприц. В этом случае в среду, выходят, интактные хло-
ропласты (диаметром 3—5 мкм). Этот метод дает хорошие результаты и, очень прост, но наряду с ним можно использовать, и другие методы. 'Гак, например, в основном иитактные хлоропласты получают при пропускании суспензии протопластов через Yecla Press под давлением 75 фунтов на кв. дюйм (5,2725 кг/см2). Протопласты САМ-расте.ний можно разрушить, пропустив их через шприц с иглой № 25. Для того чтобы получить осадок хлоропластов, практически освобожденный от фракции цитозоля, экстракт протопластов можно отцентрифу-гнровать при низкой скорости, т. е, в течение 1 мни при 250 g. Этого вполне достаточно для большинства исследований фотосинтеза, в которых используются хлоропласты, выделенные из разных растений. Для изучения внутриклеточной локализации ферментов суммарный экстракт протопластов можно наслоить иа градиент концентрации сахарозы, а затем отцентрифугиро-вать его и 'расфракционировать при помощи стандартных приемов (разд. 12.1).
Исходный материал
Клеточные стенки состоят главным образом из целлюлозы, гемицеллюлозы и белка, а пектин и пектат кальция обычно рассматривают как цементирующий материал, расположенный между клетками.
Ниже указаны фирмы, где можно приобрести те особые материалы, которые используют для выделения отдельных клеток или протопластов. Коммерческие препараты переваривающих ферментов, которые используют для этой цели, обычно представляют собой сложную смесь из нескольких ферментов. В деполимеризации пектата и пектина могут участвовать деполимеразы нескольких типов, включая такие ферменты, как полигалактуроиаза, полнметилгалактуроиаза, пектатлиаза и пектинлиаза. Вполне очевидно, что разные виды растений существенно различаются по составу пектин-иектата, который как бы цементирует клетки, связывая их воедино, поэтому не удивительно, что одни деполимеразы более эффективно действуют иа клетки одних растений, а другие — на клетки других растений. К сожалению до сих пор не удалось добиться мало-мальски значительного успеха в ферментативном выделении клеток из злаков.
Для того чтобы разрушить целлюлозу и различные гемицеллюлозы, требуется целый ряд ферментов. Можно назвать некоторые ферменты, участвующие в деградации целлюлозы: эндо-1,4-;р-глюканаза, целло'биогидролаза, целлобиаза и некий фермент, который, возможно, превращает кристаллическую целлюлозу в ее аморфную форму еще до того, как начнут дей-
Целлюлаза из Trichoderma viride (содержит ферменты, разрушающие целлюлозу и гемицеллюлозу).
Под названием “онозука ШОи RS” (Onozuka R10 и RS)
Yakult Biochemical Co. Ltd.
Enzyme Products 8-21, Shingikancho Nishinomiya Japan
Под названием “целлюлизин” (Cel- Calbiochem-Behring Calbiochcm-Beliring
