Фотосинтез С3 и С4 растений механизмы и регуляция - Эдвардс Дж.
Скачать (прямая ссылка):
Сред, которые применяют для разрушения, очень много; они различаются по составу, по общим для всех сред является то, что все они содержат осмотически активное вещество (разд. 8.10). Обычно это сахар (глюкоза или сахароза) или многоатомный спирт (типа сорбитола или маннитола) в концентрации 0,33 М. Кроме того, в среде обычно присутствует буфер, который необходим для поддержания определенной концентрации ионов водорода (очень часто, хотя и не всегда, в среде поддерживают слегка кислый pH), и антиоксидант типа аскор-бата. Во многих случаях, по-видимому, необходим также и хе-латпый агент. Когда в качестве буфера используется неорганический пирофосфат, то выполняется и это требование. Можно внести в среду и другие защитные агенты, например бычий сывороточный альбумин, но если у нас есть «хороший» шпинат, то превосходные хлоропласты можно получить, взяв .раствор, содержащий только 0,33 М сорбитол и 10 мМ Na4P207„ доведенный с помощью НС1 до pH 6,5.
• Механическое разрушение ткани не совсем подходит для получения интактных хлоропластов из С4-растсний. Процентное содержание интактных хлоропластов в препарате, полученном из клеток мезофилла, обычно очень невелико (судя по содержанию маркерных ферментов и по .пробе на интактиость с феррицианидом, разд. А.7). Клетки обкладки проводящих .пучков имеют очень толстую клеточную стенку и поэтому более устойчивы к разрушению, чем клетки мезофилла, а-следовательно, и выход хлоропластов из таких клеток ничтожен.1 При-механическом разрушении клеток С^р астений возникает ..еще одна трудность, связанная с перекрестным загрязнением получаемых препаратов хлоропластов , мезофилла й обкладки проводящих пучков (гл. 10). < , ¦ ;
А.5. Получение хлоропластов из протопластов
Этот метод получения функционально активных хлоропластов до сих пор еще не вышел из стадии становления. Он оказался особенно удобным для работы с С^-растениями, так как позволил получить в чистом виде протопласты мезофилла, из которых затем можно выделить иитактные хлоропласты. Этот метод был успешно применен и в опытах с однодольными Сз-р астениями (пшеницей и ячменем). Его можно использовать (правда, довольно ограниченно) и при работе с двудольными Сз-растениями (шпинат, подсолнечник, табак и горох), и с САМ-;растениями, например с Sedurn praealium и Mesembry-anthemum crystallinum.
Получение ткани листа
Метод, которым получают ткани листа для дальнейшего ферментативного переваривания, зависит от вида растения. Листья однодольных растений просто разрезают на кусочки обычным лезвием бритвы (делая вручную поперечные срезы через каждые 0,7—0,8 мм). Можно использовать и механический резак, позволяющий получить совершенно однородные сегменты, что намного уменьшает возможные отличия получаемых препаратов друг от друга. Эта задача кажется очень несложной, но каждый человек по-своему режет лист. У двудольных растений эпидермальный слой можно иногда отделить от нижней поверхности листа, просто ухватив его пинцетом (например, у табака и Ка1апскоё daigremontiana). Можно потереть поверхность листа наждачной бумагой или щеткой (например, зубной), но очень осторожно, чтобы не повредить те ткани, которые лежат под эпидермисом. После этого ткань листа инкубируют не более 2,5—4 ч при 25—30 °С и слабом освещении. Большая продолжительность инкубации нежелательна, так как это может привести к утрате фотосинтетических функций. Для некоторых видов растений проводят такую обработку, как введение среды, содержащей ферменты, непосредственно в сегменты листа путем вакуум-инфильтрации, или же встряхивание на качалках во время инкубации. Ни один из этих методов, по-видимому, не дает преимуществ тогда, когда берут мелко измельченные листья однодольных растений.
В качестве примера приведем состав одной из возможных сред выделения:
2%-ная целлюлаза (из Trichoderma viride)
Пектиназа (из Rhizopus sp.), 0,1%-ная для С4- и 0,3%-пая для Сз- и САМ-растений 0,5 М сорбитол
1 мМ СаСЬ
20 мМ MES-буфер, pH 5,5
0,05%-ный бычий сывороточный альбумин (обезжиренный)
Ферменты указанных выше грибов есть в продаже. Оказалось, что они удобны для работы со многими растениями, включая многие однодольные. В некоторых случаях можно увеличить стабильность протопластов и сделать более или менее постоянным выход этих структур, если предварительно обессолить или слегка очистить используемый препарат ферментов. Для видов, устойчивых к перевариванию данными ферментами, иногда бывает полезно либо заменить одни ферменты на другие, либо изменить условия выращивания.
Выделение и очистка
После того как ткань проинкубируют с переваривающими ферментами, среду выделения можно осторожно отделить и отбросить. Затем после нескольких промывок раствором осмотически активного вещества (например, 0,5 М сорбитолом, содержащим 1 мМ СаС12) получают смесь, состоящую из протопластов, хлоропластов и проводящей ткани. Непереваренный материал, в который входят эпидермальная и проводящая ткани листа, удаляют, профильтровав полученную суспензию через нейлоновое сито (материал, получаемый из Сз- и САМ-растений, фильтруют через сита с отверстиями размером 1 мм и 200 мкм, а материал, получаемый из С^-растений, — через сита с отверстиями размером 1 мм, 500 и 80 мкм). Тяжи обкладки проводящих пучков у С^растений обычно устойчивы к перевариванию, и их можно собрать иа нейлоновом оите с отверстиями 80 мкм. Низкоскоростное центрифугирование полученного экстракта в течение 5 мин при 100 g позволяет отделить осадок, состоящий из протопластов и хлоропластов. Есть два способа очистки протопластов. Протопласты мезофилла некоторых растений всплывают, когда их ресуспендируют в растворе с достаточно высокой плотностью. Так, например, если протопласты мезофилла пшеницы, ячменя или подсолнечника суспендировать в растворе, содержащем 0,5 М сахарозу, и отцент-рифугировать при низкой скорости (5 мин при 200 g), то они воплывут и соберутся в верхней части пробирки. Если необходимо, плотность среды мол-сно увеличить, добавив в нее, например, декстран (Тго или Т«) до концентрации 2—10% (вес/объем) или фиколл. Если же перед центрифугированием на среду с. сахарозой наслоить раствор (например, сорбитола) с меньшей плотностью, то после центрифугирования протопласты попадут на границу этих двух фаз. После этого их можно легко собрать пастеровской пипеткой.
