Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
растений было первоначально разработано для вирусных нуклеиновых кислот и
основывалось на аналогичных подходах,, используемых при работе с вирусами
животных.
Идеальная система трансформации с помощью чистой ДНК должна:
- защищать векторную ДНК от нуклеаз или механической деградации;
- обеспечивать эффективное введение векторной ДНК в протопласты;
- не быть цитопатогенной, обеспечивать достаточно высокую эффективность
разделения клеток и не вызывать значительного снижения их
жизнеспособности после трансфекции;
- доставлять вектор в форме, способной к интеграции с ядер-ным геномом
или, если необходимо, к существованию в виде свободного репликона;
- преодолевать барьер некомпетентности растительных клеток. В целом
методы введения ДНК в протопласты можно разделить на пять основных групп:
1. Химически стимулированный эндоцитоз (ПЭГ 6000).
2. Введение с помощью липосом.
3. Слияние бактериальных сферопластов.
4. Электропорация.
5. Микроинъекции.
Трансформация растительных клеток путем трансфекции ДНК
197
Введение ДНК с помощью липосом и трансформация протопластов путем
слияния с бактериальными сферопластами, содержащими векторные плазмиды,
использовались с переменным успехом [8, 16]. Последний метод оказался
относительно неэффективным и более трудоемким, чем трансформация путем
химически стимулируемого эндоцитоза или электропорации, и не будет
рассматриваться в данном руководстве. Таким образом, в разд. 3.2 и 3.3 мы
остановимся соответственно на методах химически стимулируемого поглощения
ДНК и электропорации. Микроинъекции могут использоваться для
трансформации клеток, а не протопластов и обсуждаются отдельно в разд.
3.4.
3.1.3. Разработка стратегий трансформации протопластов путем трансфекции
ДНК
Несколько лет назад было показано, что протопласты растений можно
трансформировать Ti-плазмидой дикого типа с помощью химически
стимулируемого эндоцитоза [10, 21]. Оказалось, что методы,
предусматривающие использование полиэти-ленгликоля (ПЭГ 6000), наиболее
надежны, хотя частота трансформации довольно низка (1-5х10~6). Она до
некоторой степени зависела как от концентрации ПЭГ, так и от количества
векторной ДНК- К сожалению, данные эксперименты ограничивались трудностью
выделения больших количеств Ti-плазмиды и недостатками
гормононезависимого роста в качестве селектируемого фенотипа. В целом
результаты разочаровывали. Было обнаружено, что во многих
трансформированных колониях интегрированы только фрагменты Ti-плазмиды и
повторы длиной 25 п. н. не использовались для интеграции. Только после
1984 г. с появлением доминантных селективных маркерных генов, которые
эффективно транскрибируются и транслируются в растительных клетках [3,
18], возобновились эксперименты по переносу генов посредством ДНК (DMGT,
от англ. DNA-media-ted gene transfer) и конструированию соответствующих
векторов.
Современные DMGT-векторы представляют собой небольшие плазмиды (см.
следующий раздел), как правило содержащие множественные сайты для
клонирования, гены резистентности к антибиотикам, приспособленные для
функционирования в растительных клетках либо в качестве доминантных
селективных маркеров, либо в экспериментах по кратковременной (транзи-
торной) экспрессии, и, кроме того, прокариотические гены устойчивости к
антибиотикам для селекции в бактериях (рис. 3.1). С этими малыми
плазмидами манипулируют in vitro, чтобы получить вектор в окончательном
виде, а затем вводят
198
Глава 3
его в Е. coli с помощью стандартной процедуры трансформации. Небольшой
размер и ослабленный контроль репликации DMGT-векторов, дающий высокое
число копий, означают, что их можно выделять в миллиграммовых количествах
из Е. coli стандартными методами и что они гораздо меньше подвержены
механическим повреждениям.
Доступность относительно больших количеств векторной ДНК с эффективно
экспрессирующимися селективными/скрини-руемыми генами возродила интерес к
трансформации посредством ДНК, и многие исследователи быстро
оптимизировали целый набор методик для достижения эффективной доставки
векторной ДНК в растительные протопласты, подразумевающие использование
липосом, полиэтиленгликоля и электропорацию
Растительный
промотор
Маркерный ген для идентификации трансформированных растительных клеток
Точка начала\^1
репликации \ \
(ориджин) \ У^уТигнал
Е. coli ^ ________полиаденилирования
бактериальный селективный маркерный ген
Рис. 3.1. Общая схема строения вектора для переноса генов посредством
ДНК.
[8, 15, 31]. В большинстве экспериментов качество и количество плазмидной
ДНК, поглощаемой протопластами, оценивались физическими методами,
например гибридизацией ДНК (блот-тинг-гибридизация по Саузерну), или
косвенно путем транзи-торной экспрессии маркерных генов либо селекции
резистентных к антибиотику, стабильно трансформированных колоний.
Впоследствии оказалось, что методики, использованные ранее для
