Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
Круг хозяев
Основной недостаток системы агробактерий - это неспособность
трансформировать злаковые, группу, к которой относится-большинство
растений, употребляемых в пищу. Причина подобного ограничения круга
хозяев в настоящее время не понятна; она, возможно, заключается в
отсутствии участков узнавания-для бактерий на поверхности растительной
клетки или в неспособности одного или более продуктов tur-генов правильно
функционировать в клетках однодольных. Однако следует отметить, что
проблема круга хозяев не ограничивается только-однодольными. В самом
деле, для многих культурных видо" двудольных до сих пор не разработаны
эффективные системы трансформации с помощью агробактерий (приложение
2[VIII]). Ткани-мишени некоторых видов растений, возможно, не в состоянии
противостоять инфекции агробактериями либо чувствительны к бактерицидным
соединениям/ и это препятствует-трансформации.
Проблемы регенерации
Очень часто культивируемые in vitro клетки, которые способны к
трансформации с высокой частотой, не являются тотипо-тентными, например
полученные из протопластов клетки или* хорошо адаптировавшиеся
суспензионные культуры. Таким образом, в случае многих видов необходимо
трансформировать.
Трансформация растительных клеток путем трансфекции ДНК.
195
ткани/клетки, способные к регенерации, но труднодоступные для
агробактерий (например, клетки семяпочки или пыльцы).'
Организация Т-ДНК
Сайт(ы) интеграции, число копий и общая организация Т-ДНК может не
подходить для последующих манипуляций и накладывать ограничения на
применение векторов на основе Т-ДНК- Это особенно важно, если необходимо
направленное встраивание гена, как, например, при его замещении путем
гомологичной рекомбинации. Однако необходимо получить гораздо больше
данных об организации Т-ДНК, прежде чем можно будет разрабатывать эту
проблему.
Работа с рекомбинантными ДНК
Из-за размера и сложности Ti-плазмиды для получения полноценного
трансформирующего вектора требуется провести ряд генно-инженерных
манипуляций. С генами, предназначенными для переноса в растительные
клетки, сначала манипулируют in vitro и в зависимости от того, становятся
ли они частью коинтегративной или бинарной векторной системы, их включают
в состав либо простой челночной плазмиды (коинтегративная система), либо
более сложной плазмиды с широким кругом хозяев (бинарная система).
Плазмиду затем вводят в Е. coli
и, наконец, переносят в агробактерии путем сложной конъюгации (разд.
1.10), называемой трехродительским скрещиванием. Для бинарных векторов
требуется репликон с широким кругом хозяев, увеличивающий размер вектора,
что приводит к меньшему числу копий в Е. coli. Следовательно, такой
бинарный вектор более трудно выделить, чем стандартный клонирующий
вектор. Кроме того, репликоны с широким кругом хозяев, как правило,
относительно нестабильны, и их следует постоянно держать под селективным
давлением. Наконец, они, как правило, содержат небольшое число уникальных
рестрикционных сайтов, пригодных для клонирования. С коинтегративными
векторами, такими, как pGV3850 (гл. 1), еще труднее манипулировать,
поскольку коинтеграция происходит с низкой частотой. Трехродительские
скрещивания, используемые в обеих системах для переноса плазмиды из Е.
coli в агробактерии, также относительно неэффективны, и на их завершение
требуется 2-3 дня. Низкая частота получения трансконъюгантов в
трехродительских скрещиваниях и низкое число копий как бинарного, так и
коинтегра-тивного векторов в агробактериях обусловливают необходимость
проведения скрининга селектированных колоний путем блот-тинг-гибридизации
по Саузерну. Она должна подтвердить, что перенос/коинтеграция
осуществились и не произошло нежелательной рекомбинации. Процедуры
конъюгации и блоттинг-
196
Глава 3
гибридизации по Саузерну отнимают много времени и усложняют эксперименты
по трансформации растений. Поэтому возникает необходимость в процедуре
переноса генов без использования агробактерий в качестве промежуточного
хозяина.
3.1.2. Трансформация растительных протопластов изолированной векторной
ДНК
Чтобы упростить манипуляции с ДНК и частично решить проблему
ограничения круга хозяев, растительные протопласты трансформируют путем
непосредственного введения векторной ДНК- Однако сразу же следует
подчеркнуть, что, хотя в настоящее время теоретически возможна
трансформация практически любой системы протопластов, проблема
регенерации трансформированных растений из полученных на основе
протопластов; тканей окончательно не решена. Поэтому трансформация
протопластов имеет ограниченное применение (некоторые возможности ее
использования обсуждаются ниже):
Введение нуклеиновых кислот в растительные протопласт" нельзя считать
новым методом. Уже в течение многих лет его> используют для изучения
распространения, репликации и экспрессии вирусов растений. Действительно,
большинство современных методов введения векторной ДНК в протопласты
