Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
(37 °С; 2 ч).
4.4.2. Выделение ядерной ДНК из протопластов
4.4.2.1. Общие положения
Высококачественные транскрипционно активные ядра в большинстве случаев
можно выделять путем мягкого лизиса протопластов растений в гипергоничных
буферах [16]. Однако данный метод применим лишь к тем видам растений, из
которых может быть получено достаточное количество протопластов. Та-
258
Глава 4
кие ядра идеально подходят для выделения ДНК, а также для синтеза мРНК
при изучении экспрессии генов in vitro ("run-offo-транокрипция) [7, 15].
4.4.2.2. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Материалы для выделения протопластов из мезофилла листа (разд. 2.7)
или суспензионной культуры (приложение 3 [I])-
- Материалы для выделения ядерной ДНК, см. разд. 4.4.1.2.
- Одноразовые пластмассовые пастеровские пипетки.
Растворы
- Тритон Х-100.
- Буфер для выделения ядер из протопластов (100 мМ глицин,
1%-ный гексиленгликоль, 2%-ная сахароза). На 100 мл:
Глицин 0,75 г
Гексиленгликоль 1,00 г
Сахароза 2,00 г
Доводят pH до 8,5 насыщенным раствором Са(ОН)г.
4.4.2.3. Методика
1. Выделяют протопласты, как описано в разд. 2.7 или в приложении 3 [I].
2. Суспендируют протопласты в буфере для выделения ядера> при 4°С (на
10б протопластов берут 1 мл буфера). Переносят суспензию в
силиконированные пробирки из корекса объемом 30 мл.
3. При постоянном перемешивании добавляют по каплям Тритон Х-100 до
конечной концентрации 0,1% и инкубируют 10 мин на льду, перемешивая
суспензию одноразовой пастеровской пипеткой, что способствует мягкому
лизису протопластов.
4. Проверяют под микроскопом, все ли протопласты разрушились, затем
осаждают ядра центрифугированием в течение 10 мин при 200 g (4 °С).
5. Далее следуют методике, изложенной в разд. 4.4.1.3, начиная со стадии
6, соответственно уменьшая все объемы.
4.5. Выделение ДНК из хлоропластов и митохондрий
4.5.1. Общие положения
Методы, используемые для выделения ДНК из органелл, весьма сходны с
методами выделения ядерной ДНК- Как правило, используют следующие
процедуры: осаждение более тяжелых
Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений
259
ядер после разрушения клеток, центрифугирование при средних скоростях для
осаждения хлоропластов и последующее высокоскоростное центрифугирование
того же самого экстракта для получения осадка митохондрий. После
промывания и обработки ДНКазой из осадков органелл выделяют ДНК (методы
практически аналогичны тем, которые используют для выделения ядерной
ДНК). Метод выделения хлоропластов приведен и в разд. 6.2.2.
4.5.2. Обеспечение
Материалы, перечисленные в разд. 4.4.1.2, и, кроме того: Оборудование и
расходуемые материалы
- Ультрацентрифуга с бакег-ротором (Beckman SW27 или Sor-val АН627).
- Центрифужные пробирки для бакет-рогора (если возможно, прозрачные).
- Два силиконированных стакана из пирекса.
- Одноразовые пластмассовые пипетки.
Растворы
- Буфер для выделения органелл [300 мМ сорбитол; 50 мМ трис-HCl, pH 8,0;
5 мМ ЭДТА; 0,1%-ный БСА; 0,1%-ный (объем на объем) 2-МЭ]. На 100 мл:
Сорбитол 5,6 г
2,0 М трис-HCl, pH 8,0 2,5 мл
0,5 М ЭДТА 1,0 мл
БСА (Sigma А-4503) 0,1 г
2-МЭ 0,1 мл.
Раствор готовят и автоклавируют без БСА и 2-МЭ, которые добавляют
непосредственно перед использованием.
- Буфер с ДНКазой представляет собой буфер для выделения органелл,
содержащий 13 мМ MgCl2. На 100 мл:
Все компоненты буфера для выделения органел (см. выше)
1,0 М MgCl2 1,3 мл
ДНКазу I (Pharmacia 27-0512-01) добавляют до концентрации 250 мкг/мл
непосредственно перед использованием
- Буфер для промывания органелл (150 мМ NaCl; 50 мМ трис-HCl, pH 8,0;
25 мМ ЭДТА, pH 8,0). На 100 мл:
5 М NaCl 3,0 мл
2 М трис-HCl, pH 8,0 2,5 мл
0,5 М ЭДТА, pH 8,0 5,0 мл
- Буфер для лизиса (50 мМ трис-HCl, pH 7,2; 20 мМ ЭДТА). На 100 мл:
2,0 М трис-HCl, pH 7,2 2,5 мл
260
Глава 4
0,5 М ЭДТА 4,0 мл
- 20%-ный саркозил (Sigma) в буфере для лизиса.
- 0,5 М ЭДТА, pH 8,0.
4.5.3. Методика
1. Нарезают 100 г листьев3' маленькими кусочками (1-2 см2) нли
измельчают 50-75 г каллуса и ^помещают в 400 мл охлажденного буфера для
выделения органелл (4°С). Гомогенизируют, как описано в разд. 4.4.1.3,
стадии 1-4б>.
2. Осаждают ядра при 700 g в течение 10 мин при 4°С. Супернатант
центрифугируют при 2000 g (4°С, 10 мин) и собирают неочищенный осадок
хлоропластов. Переносят супернатант в. чистую пробирку, а осадок
хлоропластов помещают на лед..
3. Центрифугируют при 10 000 g для осаждения митохондрий (15 мин, 4°С).
4. По отдельности суспендируют осадки органелл в 25 мл буфера,
содержащего ДНКазу. Инкубируют на льду (0°С) в течение 1 ч, время от
времени перемешивая1*).
5. Останавливают реакцию с ДНКазой, добавляя ЭДТА до концентрации 200
