Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 113

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 107 108 109 110 111 112 < 113 > 114 115 116 117 118 119 .. 184 >> Следующая

2 мл 10%-ного ДСН, тщательно перемешивают, энергично встряхивают и
затем инкубируют в пробирках на водяной бане при 65 °С в течение 12 мин,
время от времени переворачивая пробирки(r)).
•4. Добавляют 5 мл 5 М ацетата калия и перемешивают, несколько раз
переворачивая пробирку, чтобы тяжелый раст-. вор соли не задерживался на
дне пробирки. Инкубируют на льду в течение 30 мин.
Собирают образовавшийся осадок белок-ДСНг> в течение 30 мин при 12
000 об/мин (4°С). Сливают супернатант через силиконированную
фильтровальную воронку из пирекса, заполненную полипропиленовым волокном,
в чистую пробирку и добавляют 15 мл холодного (-20°С) изопропанола.
Тщательно перемешивают и затем инкубируют 30 мин при- 20 °С.
"8. Осаждают нуклеиновые кислоты центрифугированием в течение 20 мин при
8000 об/мин (4°С). Сливают супернатант и слегка подсушивают осадок,
перевернув пробирку в штативе на фильтровальную бумагу.
~7. Осторожно растворяют нуклеиновые кислоты в 700 мкл ТЭ-буфера,
переносят в пробирку Эппендорф и центрифугируют в мини-центрифуге в
течение 5 мин для удаления нерастворимых примесей.
8. Переносят супернатант в новую пробирку Эппендорф и добавляют 75 мкл 3
М ацетата натрия. Добавляют 500 мкл холодного (-20 °С) изопропанола,
тщательно перемешивают и наблюдают образование нитевидного осадка
нуклеиновых кислот. Если этого не происходит, помещают раствор на 10 мин
в смесь сухой лед - этанол.
9. Осаждают нуклеиновые кислоты в течение 30 с в настольной центрифуге и
осторожно сливают супернатант.
10. Промывают осадок 80%-ным этанолом (дважды по 1 мл), высушивают в
эксикаторе и растворяют в 80 мкл стерильной дистиллированной водыд).
Ml. Определяют концентрацию ДНКе) в реакции с дифениламином (разд. 4.6).
Если концентрация ДНК не существенна, то обычно для обнаружения одной
копии гена на одной дорожке методом блоттинг-гибридизации по Саузерну
(разд. 6.2) достаточно около 7-10 мкл препарата нуклеиновых кислот,
обработанного рестриктазамиж). Как и в случае мини-препаратов (т. е.
небольших количеств) ДНК, полученных СТАВ-методом, важно, чтобы
рестриктазы были добавлены в избытке и инкубация продолжалась 3-4 чз).
252
Глава 4
Примечания
*> См. примечание б разд. 4.2.2.
б> Для эффективной экстракции ДНК очень важно тщательно измельчить
ткань. Деллапорта с сотрудниками [4] предлагает проводить быстрое
измельчение в гомогенизаторе Polytron (типа гомогенизатора Уорринга) при
положении регулятора скорости 2-3. Тем не менее, как правило, достаточно
короткого перемешивания или короткого импульса иа встряхи-вателе (5X3 с)
при условии, что перед экстракцией ткань была тщательно растерта в
порошок в ступке с пестиком.
в> В оттаявшем экстракте ДСН может выпасть в осадок. Необходимо
проконтролировать, чтобы во время инкубации при 65 °С ДСН полностью
растворился, а экстракт был хорошо перемешан.
г> При высокой концентрации ионов калия (>1 М) формируются
нерастворимые комплексы додецилсульфата калия с белками и полисахаридами.
Эти комплексы часто образуют хлопья и удаляются центрифугированием при
относительно высоких скоростях и фильтрованием через полиалломер-ное
волокно. Осадок должен быть чисто-белого цвета, компактный и волокнистый.
Иногда целесообразно позволить ДНК набухнуть при 4°С " течение 1-2 ч,
время от времени постукивая по дну пробирки. Перед лигированием или
рестрикцией необходимо убедиться, что препарат нуклеиновой кислоты
полностью растворился.
*> Выход ДНК из листьев многих злаков составляет 40-120 мкг иа 1 г
свежего веса.
*> См. примечание р разд. 4.2.2.
(r)> Если предварительно обработать неочищенный препарат нуклеиновых
кислот прогретой РНКазой, то большинство рестриктаз можно добавлять, в
меньшем количестве. Такие препараты ДНК могут использоваться в для
лигирования.
4.3.4. Выделение ДНК из свежих тканей с помощью ДСН И протеиназы К
4.3.4.1. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы Те же, что и в разд. 4.2.3.1
Растворы
- Буфер S (100 мМ трис-НС1, pH 8,5; 100 мМ NaCl; 50 мМ
ЭДТА; 2%-ный ДСН).
На 100 мл:
2 М трис-НС1, pH 8,5 5,0 мл
5 М NaCl 2,0 мл
0,5 М ЭДТА, pH 8,0 10,0 мл
25%-ный ДСН 8,0 мл
- 10 мг/мл протеиназы К (например, Sigma, Р-0390).
- Буфер для экстракции: этот буфер следует готовить непосредственно
перед использованием, добавив в буфер S про-теиназу К до конечной
концентрации 0,1 мг/мл.
- Смесь фенол/хлороформ (разд. 4.2.3.1).
Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений
255
- Хлороформ.
- Изопропанол.
- 70%-ный этанол.
- ТЭ-буфер (разд. 4.2.3.1).
- 2,5 М К2РО4, pH 8,0. На 100 мл: готовят исходные растворьв А и В.
А 2,5 М К2НРО4 (56,06 г/100 мл)
В 2,5 М КН2Р04 (34,02 г/100 мл)
Смешивают 94,7 мл раствора А с 5,3 мл раствора В.
- 2-Метоксиэтанол (BDHAnalar).
- 10 мг/мл предварительно прогретой РНКазы (разд. 4.2.3.1)-
- 3 М ацетат натрия, pH 5,2 (разд. 4.2.3.1).
Предыдущая << 1 .. 107 108 109 110 111 112 < 113 > 114 115 116 117 118 119 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed