Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
ДНК на чистую стерильную или одноразовую пластмассовую палочку. Промыть
ДНК в избытке 70%-ного этанола для удаления солей и органических веществ
н высушить в вакууме.
д> Некоторые препараты нуклеиновых кислот могут растворяться медленно-(от
двух часов до двух дней). Нагревание может ускорить процесс, однако лучше
проводить растворение при 4°С.
4.3. Выделение ДНК из свежего растительного материала
4.3.1. Общие положения
Выделение ДНК из некоторых лиофилизированных ткаией" например
содержащих многочисленные вторично утолщенные-клетки и сосуды, может быть
затруднено. В отдельных случаях для выделения нуклеиновых кислот из
свежего материала можно использовать СТАВ-метод (разд. 4.3.2), однако для
других тканей могут потребоваться иные методики. Большинство из них тоже
основано на использовании детергента, вызывающего быструю денатурацию
белков (при этом инактивируются и нуклеазы) и растворение мембран. Один
из таких методов, впервые разработанный Деллапорта с сотрудниками [4],
изложен в разд. 4.3.3. При 0°С примеси белка и полисахаридов в экстрактах
образуют комплексы с додецилацетатом калия и выпадают в осадок, а
нуклеиновые кислоты остаются в растворе. Препараты ДНК, полученные с
помощью данного метода, могут использоваться для лигирования. Микрометод,
основанный на применении ДНС и протеиназы К, представлен в разд. 4.3.4.
Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений
249
4.3.2. Выделение больших количеств тотальной ДНК
мз свежего растительного материала с помощью СТАВ-буфера
4.3.2.1. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
Те же, что в разд. 4.2.2.1, кроме того:
- 70%-ный этанол.
- Жидкий азот.
- Большая ступка и пестщс (12-15 см в диаметре).
- Центрифуга Sorval RC-5B (либо аналогичная) с ротором 8x50 мл.
- Полиалломерные пробирки объемом 38 мл с завинчивающимися крышками
("Налджин", тип 3119).
- Водяная баня на 95°С со штативом для цеитрифужиых пробирок объемом 38
мл.
4.3.2.2. Методика
1. Быстро промывают растительный материал 70%-иым этанолом и
ополаскивают дистиллированной водой. Быстро замораживают 10 г ткани в
жидком азоте.
2. Переносят замороженную ткань в предварительно охлажденную ступку и
разламывают пестиком на кусочки. Добавляют
4 г окиси алюминия и быстро растирают ткань в мелкий порошок до того,
как она оттает.
3. Переносят гомогенат в центрифужную пробирку объемом 38 мл и добавляют
0,2 мл 2-МЭ и затем 10 мл (или больше, если требуется) двукратного СТАВ-
буфера для экстракции, предварительно нагретого до 95 °С. Немедленно
перемешивают пластмассовой палочкой и затем инкубируют в пробирке с
крышкой на водяной бане при 56 °С в течение 20 мин.
4. Далее следуют методике, предусматривающей использование
лиофилизированного растительного материала, начиная со стадии 4
приложения 4[I].
4.3.3. Выделение ДНК из свежих тканей с помощью ДСН
-4.3.3.1. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение 1 [I]) -
- Пестик и ступки (диаметром 9 см).
- Окись алюминия (Sigma, тип 305).
- Жидкий азот.
250
Глава 4
- Одноразовые пластмассовые палочки для размешивания (Sarstedt).
- Центрифуга Sorval RC-5B с ротором 8X50 мл (либо аналогичная) .
- Полиалломерные центрифужные пробирки объемом 38 мл ("Налджин", тип
3119).
- Водяная баня на 65°С со штативом для центрифужных пробирок объемом 38
мл.
- Маленькие силиконированные фильтровальные воронки из пирекса.
- Полипропиленовое волокно (Supa Aquatic Supplies Ltd.)
Растворы
- Буфер для экстракции ДНК (100 мМ трис-НС1, pH 8,0; 50 мМ ЭДТА, pH
8,0; 500 мМ NaCl, 10 мМ 2-МЭ). На
100 мл:
2.0 М трис-HCl, pH 8,0 5,0 мл
0,5 М ЭДТА, pH 8,0 10,0 мл
5.0 М NaCl 10,0 мл
2-МЭ 70,0 мкл
- Буфер трис-ЭДТА (50 мМ трис-HCl, pH 8,0; 10 мМ ЭДТА, pH 8,0). На 100
мл:
2.0 М трис, pH 8,0 2,5 мл
0,5 М ЭДТА, pH 8,0 2,0 мл.
- 10%-ный (вес на объем) ДСН в дистиллированной Н20.
- 5 М ацетат калия. На 100 мл: 49,1 г в дистиллированно" Н20.
- 3 М ацетат натрия (pH 5,2).- На 100 мл: растворяют 24,6 г (BDH
Analar) в 70 мл дистиллированной НгО, доводят pH до 5,2 ледяной уксусной
кислотой и доливают до 100 мл дистиллированной Н20.
- Изопропанол (-20 °С).
- 80%-ный этанол.
- Стерильная Н20.
4.3.3.3. Методика
1. Собирают 1 г молодых листьев, замораживают в жидком азоте и
переносят в предварительно охлажденную (жидким азотом) ступку диаметром 9
см. Добавляют небольшое количество окиси алюминия и растирают в очень
мелкий по-рошока), пока ткань не оттаяла.
2. Переносят порошок в центрифужные полиалломерные пробирки объемом
38 мл, добавляют 15 мл буфера для экстракции ДНК и размешивают
замороженную ткань пластмассовой мешалкойб).
'Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений
251
,3. Когда будет получена гомогенная суспензия, добавляют
