Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
1 Растворы РНК не имеют повышенной вязкости даже при очень Ъмсокой
^концентрации, - Прим. ред. пер.
246
Глава 4
- Центрифужные пробирки (например, "Налджин", тип 3119,. Oak Ridge
объемом 38 мл, полипропиленовые пробирки с завинчивающейся крышкой).
- Водяная баня на 37 °С со штативом для центрифужных пробирок.
- Пастеровские пипетки с широким кончиком.
Растворы
- 10 мг/мл протеиназы К (Sigma, Р-0390 в дистиллированной Н20).
- Буфер для протеиназы (100 мМ трис-HCl, pH 8,5; 100 мМ. NaCl; 50 мМ
ЭДТА, pH 8,0; 2%-ный ДСН; 0,1 мг/мл протеиназы К). На 100 мл:
2.0 М трис-HCl, pH 8,5 5,0 мл
5.0 М NaCl 2,0 мл
0,5 М ЭДТА, pH 8,0 10,0 мл
ДСН 2,0 г
10.0 мг/мл протеиназы К
(добавляют перед употреблением) 1,0 мл
- ТЭ-буфер (10 мМ трис-HCl, pH 8,0; 1 мМ ЭДТА). На
100 мл:
2.0 М трис-HCl, pH 8,0 0,5 мл
0,5 М ЭДТА 0,2 мл
- 10 мг/мл РНКазы A (Sigma, R-4875) в стерильной дистиллированной НгО.
Прогревают (5 мин, 100 °С), разливают на порции и хранят при -20 °С.
- 3 М ацетата натрия (pH 5,6). На 100 мл: растворяют 24,6 г в 50 мл
дистиллированной Н20, доводят pH до 5,6 ледяной уксусной кислотой и
доливают до 100 мл дистиллированной НгО.
- Фенол (подвергнутый перегонке): насыщают фенол, содержащий 0,1% 8-
гидроксихинолина (BDH Analar) ТЭ-буфером (pH 8,0). Хранят в темноте при
4°С не более 6 нед.
- Смесь хлороформ/изоамиловый спирт (24:1); наслаивают на эту смесь ТЭ-
буфер, pH 8,0. Хранят под тягой.
- Изопропанол.
- 100%-ный этанол.
- 70%-ный этанол.
4.2.3.2. Методика
1. Быстро замораживают в жидком азотеа) и лиофилизируюг 5 г свежего
каллуса, молодых листьев или другой ткани6*. Хранят в запаянных
пластмассовых коробках или пластиковых пакетах в присутствии осушителя
(силикагеля) при -20 °С.
Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений
247
2. Помещают лиофилизированную ткань в ступку среднего размера
(диаметром 12-15 см), осторожно разламывают большие кусочки пестиком,
добавляют 0,5 г окиси алюминия, а затем толкут в мелкий порошок.
Добавляют 40 мл буфера для протеиназы и осторожно и тщательно
перемешивают.
3. Переносят смесь в две полиалломерные пробирки объемом 38 мл с
завинчивающимися крышками. Инкубируют при
37 °С в течение 1-2 ч; время от времени для перемешивания экстрактов
следует переворачивать пробирки.
4. Добавляют в каждую пробирку по 8 мл фенола, уравновешенного ТЭ-
буфером, и по 8 мл смеси хлороформ/изоами-ловый спирт (24:1);
переворачивая пробирки, перемешивают содержимое до образования эмульсии.
Примечание: если для клонирования необходима высокомолекулярная ДНК
(>100 т.п.н.), смесь фенол/ДНК на этой и последующей стадиях перемешивают
очень осторожно, чтобы .свести к минимуму деградацию ДНК.
5. Для разделения фаз центрифугируют (5000 об/мин, 4°С, 10 мин) в
центрифуге Sorval RC-5B (или аналогичной). Стараясь не захватить
клеточный дебрис, переносят водную фазу (верхний слой) в чистые
центрифужные пробирки и повторяют экстракцию смесью
фенол/хлороформ/изоами-ловый спирт.
*6. Используя пипетку с широким концом, переносят водную фазу в новые
центрифужные пробиркив), добавляют 0,6 объема изопропанола, перемешивают,
переворачивая пробирки, и оставляют на ночь при -20 °С, чтобы нуклеиновые
кислоты выпали в осадок.
7. Собирают осадок нуклеиновых кислот центрифугированием (4°С, 8000
об/мин, 10 мин)г> и сливают супернатант.
8. Дважды промывают осадок 10 мл 70%-ного этанола, сливают спирт и
высушивают в эксикаторе.
9. Вновь растворяют осадок в 5 мл ТЭ-буферад> и хранят при -20 °С.
Примечание: если необходимо освободить осадок от РНК, проводят стадии
10-13.
10. Добавляют 7 мкл исходного раствора РНКазы (прогретой) и затем
инкубируют при 37 °С 1 ч.
11. Добавляют 2,5 мл фенола, затем 2,5 мл смеси хлороформ/ изоамиловый
спирт и осторожно эмульгируют. Разделяют фазы, как на стадии 5, и
повторяют экстракцию, используя лишь 5 мл хлороформа.
12. Добавляют 0,1 объема 3 М ацетата натрия и 2,5 объема этанола,
осаждают в течение ночи при -20 °С.
13. Собирают осадок и заново растворяют в 1,5-2,0 мл ТЭ-буфера, как на
стадиях 7-9. Хранят при -20 "С.
248
Глава 4
14. Определяют содержание ДНК в образце с помощью регистрирующего
спектрофотометра при длинах волн между 200 и 300 нм. ДНК должна давать
четко различимый пик поглощения при 260 нм (1,0 00гбо = 50 мкг/мл).
Чистые растворы ДНК должны быть прозрачными, а отношение-OD260: OD28o
составлять около 1,8.
Примечания
Для некоторых типов растительного материала целесообразно растереть.
ткань в жидком азоте. в> Для уменьшения содержания углеводов за
несколько дней (2-3 дия) до-
сбора растения можно поместить в темноту. в> Если раствор очень
вязкий, то для уменьшения механической деградаций ДНК, его можно слегка
разбавить ТЭ-буфером. г> Кроме того, можно наматывать осаждающиеся нити
