Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
s s ''
^(' + 7йг)"
1 +
а \п '
Kra
(8.344)
Это выражение можно записать в следующем виде:
п г У a, max _ у
уг{
!+¦
Кп
Kra
Таким образом, зависимость величины
yYfE
X-Y*
Ys
(8.345)
ОТ I при
фиксированных концентрациях субстрата и активатора должна
Ингибирование и активация ферментов_____________________615
Рис. 8.40. Определение величины Ка для аллостерического активатора
методом Бюка и Бюка [605] в случае димерного фермента [уравнение
(8.345)].
быть линейной. Несколько таких графиков, полученных при различных
фиксированных концентрациях субстрата и активатора, образуют семейство
прямых, пересекающих ось - i в точке, соответствующей -Ki- Аналогично
графики зависимости
= Ъ--от s или а, полученные при фиксированных кон-
у а^шах у
центрациях других лигандов, тоже представляют собой прямые. Семейство
таких прямых, полученных при варьировании концентрации s и различных
фиксированных концентрациях а или i, будет пересекать ось s в точке,
соответствующей -Кя, тогда как аналогичные прямые, полученные при
варьировании а, пересекают ось абсцисс в точке -Ка. Пример такого графика
для случая, когда изменяется концентрация активатора, представлен на рис.
8.40.
В работе [605] показано, что линейные зависимости такого типа получаются
для димерного фермента фосфорилазы (п = 2) при изменяющейся концентрации
активатора (АМР) и нескольких фиксированных концентрациях субстрата
(неорганического фосфата). Из этих результатов следует, что кинетика
действия фермента описывается в рамках согласованной модели с двумя
состояниями и исключительным связыванием.
Определение параметров для согласованной модели
Уравнение насыщения в случае фермента, кинетика действия которого
описывается в рамках согласованной модели с неисключительным связыванием
(8.266), можно преобразовать к линейной форме, проведя перегруппировку и
логарифмирование [1250]:
'g(I-^+^,)-lgL+("-'> lg(4+ir)- <а34б>
Зависимость величины, стоящей в левой части уравнения (8.346),.
€16
Глава 8
Рис. 8.41. Графики, построенные на основании данных по определению
начальной скорости, для реакции, катализируемой пируват-киназой в
присутствии аллостери-ческого ингибитора АТР (/), ал-лостерического
активатора фруктозо-1, 6-бисфосфата (III) и в отсутствие эффекторов (II)
[2237]. Графики построены по уравнению
(8.346), за исключением того, что вместо величины У* использованы
величины v/V, поскольку в опыте измерялись начальные скорости, а не
степень связывания субстрата.
от lg j должна быть линейной; наклон соответствующей
прямой равен (п-1), и она отсекает от оси ординат отрезок длиной lg L
(рис. 8.41). Для построения такого графика необходимо знать величины c( =
Kr/Kt) и a ( = s/Kn), однако описаны методы последовательного
приближения, которые позволяют определить все четыре параметра по
нескольким графикам, полученным при различных концентрациях
аллостерического активатора или ингибитора, в результате чего изменяется
кажущаяся константа L [928, 2237]. Было показано, что уравнение (8.346)
выполняется для пируваткиназы (2.7.1.40) [2237] и 6-фосфофруктокиназы (КФ
2.7.1.11) из Е. coli [1250].
Более простым является случай согласованной модели с исключительным
связыванием (с = 0), когда применимо уравнение (8.267). Это уравнение
можно преобразовать к виду '[2047]
lg а - 1) = lg L-{п- 1) lg (1 +а), (8.347)
и зависимость величины, находящейся в левой части уравнения, от lg (1+а)
будет графически представляться прямой с наклоном (п-1), которая, как и в
более сложном случае, отсекает от оси ординат отрезок, равный lg L (рис.
8.42). Показано, что уравнение (8.347) справедливо для аспартат-
карбамоилтранс-феразы (КФ 2.1.3.2) из семян пшеницы [5239].
Ингибирование и активация ферментов
617
Рис. 8.42. Графики, построенные на основании данных по определению
связывания субстрата ас-партат-карбамоилтрансферазой из семян пшеницы в
присутствии различных концентраций аллосте-рического ингибитора (UMP).
Графики построены по уравнению
(8.347). I - [UMP] = 1 ООО мкМ; II - [UMP] = 500 мкМ; III - [UMP] = 100
мкМ; IV - [UMP] = = 10 мкМ; V - [UMP]=2 мкМ;
VI - [UMP] = 1 мкМ.
Исследование нестационарной кинетики
Эффективным подходом при выборе аллостерической модели является
определение числа стадий в процессе связывания субстрата с помощью метода
возмущений и релаксационного метода. Если имеет место согласованный
механизм, описываемый уравнением (8.244), должны регистрироваться только
три времени релаксации, соответствующие переходу R^T, связыванию
субстрата на идентичных центрах R-формы фермента и связыванию субстрата
на идентичных центрах Т-формы. Если субстрат связывается только с R-
конформацией фермента, ситуация еще более упрощается и должно наблюдаться
только два времени релаксации. Так как изомеризация R^T является
мономолеку-лярной стадией, можно было бы полагать, что время релаксации
этого процесса не будет зависеть от концентрации фермента и субстрата,
однако в действительности этот переход зависит от связывания субстрата
