Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
фермента, и которую можно было бы использовать как основу для
предсказания регуляторного действия фермента в клетке и для планирования
дальнейших экспериментов.
Обзор методов, которые можно использовать при выборе моделей, сделан в
работах [5073, 2568, 5145]; мы рассмотрим только те методы, которые
применяются наиболее часто.
Ингибирование и активация ферментов
607
Анализ кривых насыщения
Форма кривой насыщения - зависимости величины Ys от концентрации s -
может дать много полезной информации при выборе модели. В простейшем
случае наличие отрицательной кооперативности (i?s>81, H<L 1) для какого-
либо лиганда исключает согласованную модель, так как связывание лиганда
протомером, находящимся в одной из форм, смещает равновесие между
протомерами в сторону данной формы. Это видно из математических
выражений, описывающих согласованный механизм. Рассмотрим лиганд s,
который связывается более прочно с ^-формой в рамках согласованной модели
(8.244),. т. е.
когда с = -^-<1.
ДТ
При этом условии можно получить выражения для отношения концентраций R- и
Т-форм при различной степени насыщения фермента. В отсутствие 5 [см.
уравнение (8.245)]
L=-fгНг* (8-325)
А Уо
и из уравнений (8.258) - (8.261) следует, что
хх L Ti с ' (8.326)
1! ъ||> (8.327)
-jI'L II (8.328)
Х4 L ~У4~~~&' (8.329)
и, так как с<1, то
(8.330)
У4 Уз Уз У\ Уо
Из уравнения (8.330) видно, что по мере увеличения насыщения будет
наблюдаться постепенное смещение системы к состоянию, характеризующемуся
более высоким сродством к лиганду, что приводит к появлению положительной
кооперативности.
Как уже отмечалось ранее, отрицательная кооперативность при связывании
лигандов может быть объяснена в рамках любой последовательной модели,
включая модели Полинга [3627], Уаймена [5176] и Эдера [21], а также с
помощью модели Кош-ланда и др. [2570], поскольку в эти модели не
.заложено никаких допущений о влиянии связывания лигандов на сродство еще
свободных центров. Таким образом, наличие отрицательной ко-
608
Глава 8
оперативности позволяет исключить согласованный механизм, но не позволяет
провести различие между другими возможными моделями.
Отрицательная кооперативность наблюдается для ряда ферментов, в том числе
для глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (КФ 1.2.1.12) из скелетных мышц
кролика [865] и СТР-синте-тазы (КФ 6.3.4.2) [2778], причем для последнего
фермента наблюдается смешанная кооперативность при связывании глутамина
(рис. 8.36).
Более искусственным подходом при выборе моделей является
сравнение теоретических кривых, построенных согласно уравне-
ниям для различных моделей, с экспериментальными кривыми связывания. Для
фермента, связывающего четыре молекулы субстрата, уравнение Эдера можно
записать в следующей форме:
s 2 s2 3s3 4s4
у Pi Рг Рз Р4 /о оо т \
s /, s s2 s3 s4 \ ' (8.331)
4( + Pi + Р2 + Рз + Р4)
где Pi - константы, представляющие собой комбинации кажущихся констант
диссоциации. Уравнения, соответствующие другим моделям, после необходимых
преобразований и комбинирования входящих в них констант, также можно
записать в форме, аналогичной (8.331). Это уравнение можно использовать
для построения серии кривых насыщения при различных значениях р, с тем,
чтобы найти среди них кривую, совпадающую с экспериментальной кривой
связывания. Ясно, что такая обработка данных является очень трудоемкой,
если она проводится без использования ЭВМ. Эффективность такого подхода
при выборе модели обусловлена тем, что сама модель накладывает
определенные ограничения на пределы, в которых значения отдельных
констант р могут изменяться независимо, и, таким образом, ограничивает
число теоретических кривых. Например, в согласованной модели с
исключительным связыванием, а также квадратной и прямоугольной моделях
Полинга {уравнения (8.239) и (8.241)] имеются только две независимые
константы (Кя и L). Таким образом, в этих случаях только две константы р
в уравнении (8.331) могут быть действительно независимы.
Такой способ подгонки кривых весьма полезен для решения вопроса о том,
объясняет ли данная модель кооперативное действие фермента [888]. Однако
этот метод выбора моделей ограничен тем обстоятельством, что несколько
моделей могут накладывать одинаковые ограничения на константы р. Кроме
того, есть два практических момента, которые нужно учитывать: во-первых,
экспериментальные точки всегда определяются с ка-
Ингибирование и активация ферментов
609
кой-то ошибкой, и поэтому удовлетворительно согласовываться с опытными
данными могут сразу несколько теоретических кривых, отвечающих разным
моделям, во-вторых, подгонка теоретических кривых является довольно
сложным процессом и часто кажется, что можно пренебречь плохим
соответствием в одной части кривой, если наблюдается хорошее соответствие
в других, поэтому необходима статистическая оценка точности подгонки всей
кривой (см., например, [889]).
При другом, довольно близком подходе [2924, 4610, 5147] уравнение Эдера
