Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
активаторами являются ионы металлов, были определены константы
стабильности (константы ассоциации комплексов металл-лиганд) для
нескольких обычных субстратов; все эти данные сведены в таблицы [421]:.
Следует, однако, иметь в виду, что прочность связывания часто зависит от
условий (pH, температуры); кроме того, активатор может образовывать
комплексы "с посторонними" компонентами системы, поэтому константы
стабильности следует определять в конкретных экспериментальных условиях.
Для определения связывания одного из обычных активаторов, Mg2+, был
предложен метод с использованием 8-оксихинолина, который изменяет спектр
поглощения при связывании с ионом металла [638].
Основанный на кинетических данных вывод о том, что активация обусловлена
взаимодействием активатора и субстрата, получает дальнейшее
подтверждение, если независимым путем удается показать, что такое
взаимодействие имеет место, и если можно измерить величину Ка• Например,
по результатам исследования взаимодействия Mg2+ с АТР (см., например,
[638, 3566]) была расссчитана константа диссоциации комплекса Mg2+-АТР на
Mg2+ и АТР, которая оказалась достаточно близкой к величине, полученной
из кинетических данных для кре-атинкиназы [3448]. Это говорит в пользу
предположения о том, что комплекс является субстратом креатинкиназы.
Моррисон и др. [3263]' считают, что поскольку Mg2+ связывается с ADP
относительно слабо, то в ходе обратной реакции (ADP+креатин-фосфат->-)
комплекс Е-Mg-ADP может образовываться в результате соединения
компонентов в любой последовательности.
Установление механизма значительно облегчается, если активация фермента
зависит от времени. Нередко активация под действием ионов металлов
достигает максимума только через несколько часов. В таких случаях для
определения активности требуется предварительная инкубация активатора с
ферментом, так как взаимодействие активатора с ферментным белком (для
которого присутствие субстрата не обязательно) осуществляется
относительно медленно. Предварительная инкубация активатора с субстратом
в отсутствие фермента не дает эффекта. Ферменты, ведущие себя подобным
образом, например аргиназа (КФ 3.5.3.1) |[219], активируются,
следовательно, по механизму, в котором активной формой фермента является
ЕА (в данном :случае А - ион металла). Такого рода временные эффекты,
видимо, обычны для активации ионами Мп2+ или Со2+
Ингибирование и активация ферментов
561
пептидаз и некоторых сходных ферментов, действующих на азотсодержащие
группировки; у ферментов, активируемых ионами Mg2+, эти эффекты обычно не
наблюдаются.
Если константа Михаэлиса для субстрата при определенной концентрации
активатора равна константе Михаэлиса для активатора при определенной
концентрации субстрата (которая совпадает с использовавшейся в первом
случае концентрацией активатора), то весьма вероятно, что металл и
субстрат соединяются в комплекс, который и служит истинным субстратом
фермента, и что только этот комплекс соединяется с ферментом в сколько-
нибудь значительной степени. Это заключение основывается на том
соображении, что если свободный металл или свободный субстрат соединяются
с ферментом столь же эффективно, как AS, то величины Кш определенные в
указанных выше условиях, не могут быть одинаковыми. Если же с ферментом
могут соединяться и свободный металл, и свободный субстрат, и AS и если
при этом сродство фермента к металлу и к субстрату одинаково, то для
скорости реакции также получается выражение, симметричное относительно
концентраций активатора и субстрата. Эта последняя возможность
представляется, однако, весьма маловероятной.
РАВНОВЕСНЫЕ ЭФФЕКТЫ
Образование комплексов активатор-субстрат (в частности, и тех, которые не
атакуются ферментом) приводит к изменению константы равновесия
катализируемой ферментом реакции; эти изменения, которые зависят от
природы и концентрации активатора, будут рассмотрены ниже.
Предположим, что протекает обратимая ферментативная реакция Sf^Sb с
константой равновесия
и допустим, что и S/, и S& образуют комплексы с активатором А; обозначим
при этом константы диссоциации соответственно через Kaf и КаЬ- Тогда
(8.186)
(8.187)
где а - концентрация свободного активатора, Sf и s& - концентрации
свободных S/ и Sb, Qs и qb - концентрации соответственно ASf и ASb-
562
Глава 8
Суммарные концентрации субстратов будут равны
sbt=sbJrc!b-
(8.188)
(8.189)
Kt - "кажущаяся" константа равновесия, выраженная через суммарные
концентрации добавленных субстратов,- по определению равна
Подставляя в это выражение (8.186) - (8.189), получаем
Это уравнение показывает, как изменяется константа равновесия при
изменении концентрации свободного иона металла; из него следует, что если
Ка/ отличается от Каь, то наблюдаемая ' константа равновесия будет
отличаться от истинной константы, определяемой в отсутствие металла.
Экстраполируя Kt при а->¦ -->-0, можно определить величину К. Для этого
строят график зависимости между определенными экспериментально значениями
