Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
боковыми группами образуются соответствующие карбоксиметильные
производные. Анализ и идентификация смеси продуктов позволяют получить
определенную информацию о природе групп, окружающих связывающую ацильный
фрагмент группу активного центра.
Различные подходы, использующиеся при идентификации групп
субстратсвязывающих участков ферментов, рассмотрены в работе [4724]. Эти
подходы дают, однако, фрагментарную картину-они позволяют выяснить
природу лишь некоторых групп активного центра; для получения же общего
представления о строении всего центра необходимо суммировать результаты,
полученные с помощью различных методов. Рассмотренные подходы не могут,
следовательно, заменить метод рентгеноструктурного анализа, который
позволяет установить полную трехмерную структуру активного центра. С
другой стороны, эти подходы оказываются весьма эффективными при изучении
многих ферментов, которые еще не могут быть исследованы
рентгеноструктурным методом.
ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ
Для выяснения механизма действия фермента необходимо сопоставить
информацию различного рода. Ниже мы суммируем основные сведения, которые
позволяют получить достаточно полное представление о механизме действия
фермента.
Прежде всего нужны детальные данные о первичной и третичной структуре
фермента, особенно в области активного центра; такие данные были получены
для ряда ферментов с помощью рентгеноструктурного анализа и метода
определения аминокислотной последовательности (см. гл. 10). Для
ферментов, которые не могут быть исследованы обоими этими методами,
некоторую информацию удается получить с помощью рассмотренных в
предыдущем разделе методов, основанных на использовании разного рода
ингибиторов (см. гл. 8). Необходима также информация о строении,
физических и химических свойствах простетической группы фермента (если
она имеется), в том числе о ее спектре поглощения в видимой и
ультрафиолетовой областях (см. гл. 9),
Механизм действия ферментов
405
а также о каталитически важных атомах металла (см. гл. 8), в частности об
их спектрах ЭПР. Изучение мутантных форм фермента тоже может служить
источником информации о влиянии на активность замены определенных
аминокислот и, таким образом, способствовать выяснению каталитического
механизма (см. гл. 12).
Необходимо также располагать данными о структуре субстрата, чтобы
сравнить его исходную конфигурацию с той, которую он принимает в фермент-
субстратном комплексе. Такие же данные желательно иметь и о продукте.
Если для реакции необходимы какие-либо другие компоненты, например
активаторы, то нужно иметь представление о характере их действия (см. гл
8 и 9), о природе взаимодействия с ферментом, о том, какие изменения
конфигурации фермента и особенно его активного .центра происходят при
связывании этих компонентов и какие химические изменения претерпевают они
в процессе реакции.
Важно иметь как можно более полную трехмерную картину фермент-
субстратного комплекса - такую, какая была получена для ряда ферментов с
помощью рентгеноструктурного анализа. Далее следует установить, как
происходит связывание молекулы ¦ субстрата в активном центре, какие
группы участвуют в связывании и каким образом субстрат удерживается в
надлежащей для протекания реакции ориентации. Сравнение структуры
свободных субстрата и фермента со структурой их в составе фермент-
субстратного комплекса позволяет судить об изменении конформации молекулы
субстрата в результате связывания с активным центром и конформации
фермента при связывании субстрата; это помогает установить, какие
напряжения возникают в ферменте и субстрате при образовании комплекса, а
также высказать предположения об их роли в осуществлении реакции.
Возможно, удастся выяснить также характер микроокружения различных групп
и различных частей молекулы субстрата, например выявить наличие локальных
электростатических полей, обусловленных сближением заряженных групп,
которые могут играть важную роль в катализе.
В отсутствие рентгеноструктурных данных ценную информацию о
конфигурационных взаимоотношениях между активным центром и субстратом
можно получить, изучая влияние модификации структуры субстрата на его
сродство к ферменту, т. е. ис-.следуя специфичность (см. гл. 6), а также
на основании аналогичных исследований с конкурентными ингибиторами,
сходными по структуре с субстратом (см. гл. 8). Для установления собст-
.венно механизма реакции используется несколько методов. Ин-.термедиаты,
имеющие характерные спектры поглощения в видимой или ультрафиолетовой
областях, спектры ЯМР, ЭПР, ДОВ и т. д., идентифицируют с помощью методов
регистрации быст-' рых реакций (см. гл. 4), при этом наиболее эффективным
оказы-
406
Глава 7
вается метод быстрого замораживания, позволяющий остановить реакцию через
определенные промежутки времени. Для выявления связи, по которой
происходит расщепление в ходе реакций гидролиза и переноса групп,
используют изотопы, в частности-180. По наличию или отсутствию оптической
