Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Диксон М. -> "Ферменты 2" -> 4

Ферменты 2 - Диксон М.

Диксон М., Уэбб Э. Ферменты 2 — М.: Мир, 1982. — 515 c.
Скачать (прямая ссылка): fermentit21982.djvu
Предыдущая << 1 .. 2 3 < 4 > 5 6 7 8 9 10 .. 158 >> Следующая

этим данным можно составить представление о протяженности активного
центра. Необходимо, однако, подчеркнуть, что такой подход ограничен теми
немногими случаями, когда фермент-субстратный комплекс достаточно
стабилен в кристаллическом состоянии и может быть исследован методом
рентгеноструктурного анализа. С первого взгляда кажется, что такая
ситуация крайне маловероятна, и тем не менее в ряде случаев удается
получить стабильные ES-комплексы либо путем выбора соответствующих
условий (например, pH), при которых скорость реакции снижается
практически до нуля, либо путем добавления к ферменту, катализирующему
двухсубстратную реакцию, только одного субстрата. Однако тот факт, что
реакция не идет, может свидетельствовать об отсутствии нормальной
активной структуры.
Для большинства ферментов трехмерная структура ES-комп-лекса не
установлена и для идентификации групп, входящих в состав активного
центра, приходится прибегать к косвенным методам.
Основным подходом, позволяющим установить, участвует ли в катализе та или
иная группа активного центра, является обработка фермента химическим
реагентом, который специфически атакует данную группу, образуя стабильное
соединение. Если группа является существенным компонентом активного
центра, то модифицированный фермент оказывается неактивным; природа
модифицированной группы и ее положение в белковой цепи могут быть
определены обычными методами установления аминокислотной
последовательности. Эта задача облегчается при использовании
радиоактивного реагента.
Очевидной трудностью, с которой сопряжен этот подход, является выбор
реагента, специфичного к одной определенной группе. Идентифицируемая
группа - это, по-видимому, боковая цепь какой-либо аминокислоты, а в
белковой молекуле может
Механизм действия ферментов
403
присутствовать несколько остатков данной аминокислоты, при чем
большинство из них не находятся в области активного цент-, ра. Скорее
всего используемый реагент будет специфичен к данной аминокислоте вообще,
а не к индивидуальному остатку, так что в ферменте окажется несколько
меченых остатков и будет трудно решить, какой из них находится в активном
центре, т. е. установить, модификация какого именно остатка вызывает
ингибирование.
Известны, однако, реагенты, специфичные к конкретным остаткам, они
реагируют только с теми из них, которые находятся в определенном
окружении. Например, диизопропилфторфос-фат (DFP) очень легко реагирует
со строго определенным остатком серина в молекуле фермента, а иодацетамид
реагирует с существенно разной скоростью с различными остатками цистеи-на
в белках. Следует все же отметить, что только в немногих случаях реагенты
оказываются достаточно высоко специфичными к индивидуальным остаткам и с
их помощью удается идентифицировать группы активных центров. Однако эти
трудности можно преодолеть, если использовать способность субстрата
защищать функциональную группу активного центра. В условиях насыщения
фермента субстратом до обработки реагентом в результате взаимодействия с
субстратом группы субстратсвязы-вающего участка окажутся
заблокированными, в то время как другие группы такого типа, не
находящиеся в активном центре, будут вступать в реакцию с реагентом. Если
затем избыток реагента и субстрата удалить путем диализа, а фермент снова
обработать реагентом, но на этот раз радиоактивным, то группы, не
находящиеся в активном центре, не смогут реагировать, поскольку они уже
блокированы нерадиоактивным реагентом, группы же активного центра вступят
в реакцию, так как они теперь не защищены субстратом. В результате
радиоактивная метка окажется включенной только в группы, находящиеся в
области активного центра, и их локализация в белковой цепи может быть
установлена обычными методами. Этот подход с использованием меченого DFP
(см. с. 440) применен в работе [812] t при исследовании
ацетилхолинэстеразы (КФ 3.1.1.7).
Вместо субстрата в ряде случаев подобным образом можно использовать
аналоги субстрата или конкурентные ингибиторы, которые взаимодействуют с
субстратсвязывающим участком. Некоторые аналоги субстратов могут быть
также использованы по принципу "аффинной метки". Аффинная метка - это
конкурентный ингибитор, имеющий активную группу, обычно галоидсодержащую,
которая необратимо (ковалентно) связывается с ферментом. Благодаря своей
специфичности фермент взаимодействует с субстрат-подобной частью реагента
в активном центре, и последний оказывается меченым в результате
необратимой реакции.
404
Глава 7
Подход, который был применен при исследовании некоторых ферментов
(например, химотрипсина), образующих ковалентные интермедиаты, получил
название фотомаркировки. Субстрат с диазоацильной группой (вместо обычной
ацильной) образует диазоацилфермент. При освещении ультрафиолетовым
светом диазоацильная группа превращается в очень реакционноспособную
карбеновую группу, при взаимодействии которой со многими соседними
Предыдущая << 1 .. 2 3 < 4 > 5 6 7 8 9 10 .. 158 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed